阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制研究

姚阳，周民，卢绪章，姜玉，岑岭，张修文，杨建和

(1.泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300；2.常州市第三人民医院，江苏 常州 213000；3.南京医科大学附属常州第二人民医院 江苏 常州 213000)

·论 著·

阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制研究

姚阳1，周民2，卢绪章3，姜玉3，岑岭3，张修文3，杨建和3

(1.泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300；2.常州市第三人民医院，江苏 常州 213000；3.南京医科大学附属常州第二人民医院 江苏 常州 213000)

目的：探讨阿霉素增强细胞因子诱导的杀伤性(CIK)细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制。方法：用阿霉素处理骨髓瘤细胞株U266以及患者骨髓瘤细胞，流式细胞仪(FCM)检测细胞表面NKG2D配体(MICA/B和ULBPs)表达的变化及CIK细胞对U266细胞杀伤作用的变化。结果：阿霉素处理后U266细胞表面MICA/B表达明显升高(P=0.002)，而ULBPs的表达无明显变化。阿霉素亦能够诱导患者骨髓瘤细胞表面MICA/B的表达增加。CIK细胞对阿霉素处理过的U266细胞杀伤作用明显增加(P=0.01)，这种杀伤作用可以被抗NKG2D抗体部分抑制(P=0.03)。结论：化疗药物诱导骨髓瘤细胞表面MICA/B表达的增加，从而增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用。

NKG2D配体；细胞因子诱导的杀伤性细胞；骨髓瘤细胞

细胞因子诱导的杀伤性(cytokine-induced killer，CIK)细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，并在临床得到广泛的应用[1-2]。增强CIK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤力是CIK细胞治疗的关键。研究发现，CIK细胞表达较高水平的NKG2D受体，它能够识别肿瘤细胞表面相应的NKG2D配体，从而对肿瘤细胞实施杀伤作用[3-5]。NKG2D的配体包括MHC Ⅰ类分子(MICA/B)和ULBPs，它在正常的细胞或者组织不表达，但是在肿瘤细胞或者病毒感染的细胞表面表达增加。放射线、化学药物等因素可以诱导肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[6-7]。蒽环类化疗药物阿霉素为细胞周期非特异性药物，是临床上治疗多发性骨髓瘤的常用药。我们利用阿霉素诱导骨髓瘤细胞表面NKG2D配体的表达增加，探讨阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

骨髓瘤细胞株U266由上海长征医院血液科侯健教授惠赠，细胞置含10%灭活胎小牛血清(FBS)、100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素的PRMI1640培养液，于5%CO2、37℃条件下培养。阿霉素(浙江海正药业)；流式细胞抗体包括抗CD138-FITC抗体购于BD公司，抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗体购于R&D公司。流式细胞仪(FCM)为BD公司产品。

1.2 标本的来源

研究对象为来自常州市第二人民医院血液科初诊为多发性骨髓瘤的13例患者，其中男5例，女8例，中位年龄52岁(30～77岁)。诊断均符合中国多发性骨髓瘤诊治指南(2011)。根据ISS分期，Ⅰ期1例、Ⅱ期8例、Ⅲ4例。

1.3 方法

1.3.1 FCM检测阿霉素骨髓瘤株U266 细胞表面NKG2D配体 取U266细胞1×105(100ml)-1，分别加入抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗体4μl，4℃避光孵育30min后用PBS洗两遍，用500ml PBS悬浮后上机检测，每标本记录细胞数为1×104个。在培养液中加入阿霉素(终浓度5μg·ml-1)与U266细胞共培养24h后用FCM分析其表面的NKG2D配体(MICA/B和ULBPs)的变化。利用FlowJO 软件分析U266细胞表面NKG2D配体的表达水平，用平均免疫荧光强度(MFI)表示NKG2D配体的表达水平，MFI值小于10定义为阴性(-)。

1.3.2 FCM检测患者骨髓瘤细胞表面NKG2D配体 利用密度梯度离心法分离骨髓瘤患者骨髓中的单个核细胞，取骨髓单个核细胞1×105(100ml)-1，分别加入抗CD138-FITC抗体和抗MICA/B-PE或ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗体各4μl，用FCM分析CD138阳性细胞(骨髓瘤细胞)表面NKG2D配体的表达水平。利用FlowJO 软件进行数据分析。

1.3.3 FCM检测CIK细胞对U266细胞杀伤作用 利用FCM检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用[8]，靶细胞(U266)预选用0.1mmol·L-1Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15min后，标定的靶细胞用PBS洗两次，按照5×105孔-1放入圆底的U型管中，然后按照效∶靶比=10加入CIK细胞，在培养箱里共孵育10h后用PBS洗1次，再用结合缓冲液重新混悬细胞，然后用加入7-AAD抗体在常温中孵育15min后用FCM检测特异性杀伤率。特异性杀伤率=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在对照孔中活细胞的所占的比率，TE表示测试管中活细胞所占的比率)。在抗体阻滞实验中CIK细胞与10μg·ml-1抗-NKG2D抗体预先一起孵育30min，然后加入到靶细胞中。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行分析，U266细胞表面NKG2D配体水平的变化、CIK细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阿霉素对骨髓瘤细胞NKG2D配体的影响

阿霉素处理24h后，U266细胞表面的MICA/B表达明显增加，ULBPs(包括ULBP1、2、3)水平无明显变化(表1)，提示阿霉素诱导了U266细胞表面MICA/B的表达。

表1 阿霉素对骨髓瘤细胞株U266表面NKG2D配体表达的影响

组 别NKG2D配体表达MICA/BULBP1ULBP2ULBP3阿霉素处理前178±15.62.5±1.35.6±3.63.4±2.1阿霉素处理后286±21.65.6±3.66.3±4.23.1±1.6t值7.0211.4030.2190.854P值0.0020.2330.8370.854

2.2 患者骨髓瘤细胞表面NKG2D配体表达水平

大多数患者骨髓瘤细胞表面表达一定水平的NKG2D配体(表2)。用阿霉素处理其中2例患者骨髓瘤细胞后，其表面NKG2D配体的水平有一定增加(未展示)。

表2 患者骨髓瘤细胞表面NKG2D配体表达水平

患者编号NKG2D配体表达MICA/BULBP1ULBP2ULBP3116752653211102521253----4----576-632-6-18910892867589-2054-8275---9----10----11----12--634-13508---

2.3 CIK细胞对骨髓瘤细胞杀伤活性

当效∶靶比为10∶1时，CIK细胞对U266细胞特异性杀伤为(48.8±4.8)%，阿霉素处理U266细胞后，CIK细胞杀伤作用增加至(65.8±5.5)%，两者差异有统计学意义(P=0.01)(图1A)。我们用抗NKG2D抗体预先处理CIK细胞后其对U266细胞的杀伤作用下降了[(38.2±4.6)%]，差异有统计学意义(P=0.03)(图1B)。

3 讨 论

NKG2D配体在正常组织中很少表达，但是在肿瘤细胞表面可以检测到高水平的NKG2D配体[6，9，10-11]。免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤与其表面NKG2D配体的表达水平相关[6，12]。因此，诱导肿瘤细胞表面的NKG2D配体表达可以增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

A.CIK对阿霉素处理前后的U266细胞杀伤作用；

B.抗NKG2D抗体阻断后CIK对U266细胞杀伤作用

图1 CIK细胞对骨髓瘤细胞株U266杀伤作用

本研究结果显示：低浓度的阿霉素处理后骨髓瘤细胞株表面的MICA/B明显增高，用阿霉素处理的两例患者骨髓瘤细胞亦得到类似的结果；CIK细胞对阿霉素处理后U266细胞的杀伤作用明显提高，说明化疗药物可以增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用；用抗NKG2D抗体可以明显阻滞CIK细胞对U266杀伤作用，说明CIK细胞对U266杀伤作用部分是由NKG2D受体与配体相互作用介导的，阿霉素增强CIK细胞抗骨髓瘤细胞可能是通过诱导NKG2D配体表达增加来实现的。

综上所述，低浓度的化疗药物可以增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用，通过刺激骨髓瘤细胞表面NKG2D配体的表达增加而增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的识别和杀伤作用。

因此，我们可以通过化疗联合CIK细胞治疗肿瘤，增加CIK细胞的治疗效果，为临床治疗肿瘤提供新的策略。

[1] LINN Y C，LAU S K，LIU B H，et al.Characterization of the recognition and functional heterogeneity exhibited by cytokine-induced killer cell subsets against acute myeloid leukaemia target cell[J].Immunology，2009，126(3):423-435.

[2] HONTSCHA C，BORCK Y，ZHOU H，et al.Clinical trials on CIK cells：first report of the international registry on CIK cells (IRCC)[J].J Cancer Res Clin Oncol，2010，137(2)：305-310.

[3] BOERMAN G H，Van OSTAIJEN-TEN DAM M M，KRAAL KC，et al.Role of NKG2D，DNAM-1 and natural cytotoxicity receptors in cytotoxicity toward rhabdomyosarcoma cell lines mediated by resting and IL-15-activated human natural killer cells[J].Cancer Immunol Immunother，2015，64(5)：573-583.

[4] 何金媛，贾祝霞，蔡晓辉，等.NKG2D在细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK)抗血液肿瘤细胞的作用[J].中国实验血液学杂志，2013，21(6):1380-1384

[5] 马玲娣，朱志超，卢绪章，等.苦参碱对K562细胞NKG2D配体表达的影响及机制研究 [J].中华血液学杂志，2014，35(5)：438-442.

[6] POGGI A，CATELLANI S，GARUTI A，et al.Effectiveinvivoinduction of NKG2D ligands in acute myeloid leukaemias by all-trans-retinoic acid or sodium valproate[J].Leukemia，2009，23(4)：641-648.

[7] 卢绪章，蔡晓辉，马玲娣，等.NKG2D介导正常人NK细胞对白血病细胞的杀伤作用[J].中华血液学杂志，2012，33(6)：444-447

[8] CHOLUJOVA D，JAKUBIKOVA J，KUBES M，et al.Comparative study of four fluorescent probes for evaluation of natural killer cell cytotoxicity assays[J].Immunobiology，2008，213(8)：629-640.

[10] 韩文敏，贾祝霞，姜玉，等.可溶性NKG2D配体降低NK细胞对骨髓瘤细胞杀伤功能的研究[J].实用临床医药杂志，2015，19(24):134-135.

[11] JINUSHI M，VANNEMAN M，MUNSHI N C，et al.MHC class Ⅰ chain-related protein A antibodies and shedding are associated with the progression of multiple myeloma[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(4)：1285-1290.

[12] OBEIDY P，SHARLAND A F.NKG2D and its ligands[J].Int J Biochem Cell Biol，2009，41(12)：2364-2367.

Mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells

YAO Yang1，ZHOU Min2，LU Xu-zhang3，JIANG Yu3，CEN Ling3，ZHANG Xiu-wen3，YANG Jian-he3

(1.TaizhouPolytechnicCollege，Taizhou225300，China；2.ChangzhouNo.3People′sHospital，Changzhou213000，China；3.theAffiliatedChangzhouNo.2People′sHospital，NanjingMedicalUniversity，Changzhou213000，China)

Objective: To explore the mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells.Methods: Multiple myeloma cell line U266 and the cells from patients with multiple myeloma were treated with adriamycin，the expression of NKG2D ligands (MICA/B and ULBPs) were analyzed by flow cytometry (FCM).The cytotoxicity of CIK cells against U266 cell was detected by flow cytometry.Results: The expression of MICA/B on multiple myeloma cell line U266 was up-regulated after treated with adriamycin (P=0.002)，however expression of ULBPs had no changed.The expression of MICA/B on primary plasma cells was also up-regulated after treated with adrimycin.The cytotoxicity of CIK cell against U266 was significantly increased by treated with adriamycin (P=0.01)，and the enhancing cytotoxicity was partly blocked by anti-NKG2D Abs (P=0.03).Conclusion:The cytotoxicity of CIK cells against multiple myeloma an enhance by treated with adriamycin through Up-regulating of MICA/B.

doxorubicin；cytokine-induced killer cells；multiple myeloma cell

2016-05-13

2016-08-22

2014年泰州市科技支撑社会发展计划(指导性)项目(201433)；常州市卫生局青年科技项目(QN201203)；常州市卫生局重大项目(ZD201311)

姚阳(1969-)，男，重庆市人，副教授。E-mail:13961018417@163.com

周民 E-mail：zhoumin@medmail.com

姚阳，周民，卢绪章，等.阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制研究[J].东南大学学报:医学版，2017，36(1)：20-23.

R329.2

A

1671-6264(2017)01-0020-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.006