EGFR及KRAS基因突变与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

王 珊，董丽儒，刘爱东，熊艳杰，任会强，宋旭东

EGFR及KRAS基因突变与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

王 珊，董丽儒，刘爱东，熊艳杰，任会强，宋旭东

目的 探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者EGFR及KRAS基因突变与其临床病理特征的关系。方法 采用毛细管电泳法及荧光探针法分别检测64例NSCLC组织中EGFR及KRAS基因的突变类型。结果 64例NSCLC中发生EGFR基因突变27例(占42.2%)、KRAS基因突变8例(占12.5%)，同时发生EGFR和KRAS基因突变者4例(占6.25%)。EGFR基因突变与患者性别、组织学类型及吸烟史有关(P<0.05)，与患者年龄、分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期无关(P>0.05)。肺腺癌中KRAS基因突变率明显高于肺鳞癌(P<0.01)，KRAS基因突变与患者性别、年龄、有无吸烟史、分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期均无关(P>0.05)。结论 NSCLC患者中EGFR基因突变率高于KRAS基因突变率，EGFR突变率在女性、肺腺癌、不吸烟患者中较高，KRAS基因突变率在腺癌患者中较高，且EGFR和KRAS基因突变可以同时发生。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；EGFR；KRAS；基因突变

肺癌是影响人类生存的重大疾病之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌总数的80%。目前，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)及鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)已经明确为NSCLC发生的驱动基因[1]。本文通过检测64例NSCLC中EGFR及KRAS基因状态，分析两者的突变率及其与临床病理特征的相关性，为临床研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集河北省唐山市人民医院2015年9月到2016年2月及华北理工大学附属医院2012年1月～2016年6月期间经组织学证实的NSCLC石蜡标本共64例。所有病例临床病理资料完整，且患者术前均未行化、放疗。其中肺腺癌38例，肺鳞癌26例，年龄41～81岁，中位年龄61岁。

1.2 主要试剂 石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根生化公司)、EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法)、KRAS基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法)均购自北京鑫诺美迪基因检测公司。

1.3 主要仪器 BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR基因扩增仪、ABI 3100测序仪。

1.4 方法

1.4.1 样本准备 选择富含肿瘤细胞的石蜡包埋NSCLC组织，每例标本连续切5张(每张10 μm)白片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5 mL EP管中。

1.4.2 样本处理和核酸提取 按说明书采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取样本DNA。

1.4.3 检测方法 采用PCR-荧光探针法检测KRAS基因状态，采用毛细管电泳法检测EGFR突变情况，两者扩增引物序列详见表1。PCR反应条件：预变性95 ℃ 3 min，1个循环，变性94 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 45 s，共45个循环。

1.4.4 结果分析 通过Bio-Rad CFX Manager分析KRAS基因突变结果，通过Bio-Edit软件对EGFR测序结果进行分析。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，基因突变状态与临床病理特征分析采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变 64例NSCLC中发现EGFR基因突变共27例(图1)，突变率为42.2%。涉及单位点突变23例，占85.2%(23/27)，包括19号外显子突变12例，21号外显子突变7例，18号及20号外显子突变各2例。其余4例为双位点突变，占14.8%(4/27)，其中2例为20与21号外显子突变，1例为18与20号外显子突变，1例为19与20号外显子突变，占突变总数的14.8%(表2)。统计分析显示，19号外显子的突变率(20.3%)明显高于18号外显子的突变率(4.7%)(P<0.01)，其余位点突变率之间的差异无统计学意义(P>0.05，表3)。此外，在NSCLC患者中，女性患者的EGFR基因突变率高于男性(P<0.05)，肺腺癌及无吸烟史患者的突变率显著高于肺鳞癌及有吸烟史的患者(P<0.01)，而EGFR基因突变与患者年龄、腺癌分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期无关(P>0.05，表4)。

表1 EGFR及KRAS扩增引物序列

2.2 KRAS基因突变 64例NSCLC中KRAS基因突变共8例(图2)，突变率为12.5%，且均为第2外显子的12号密码子突变(表2)。统计分析显示肺腺癌患者的突变率明显高于肺鳞癌患者(P<0.01)，而KRAS基因突变与患者性别、年龄、吸烟史、分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无关(P>0.05，表4)。此外，本组实验结果显示有4例肺腺癌患者同时存在EGFR基因突变和KRAS基因突变，其中EGFR均为单位点突变，1例18号外显子点突变，3例为19号外显子缺失突变(表2)。

3 讨论

人EGFR基因位于第7号染色体p13-q22区，由28个外显子构成，编码1 186个氨基酸。EGFR蛋白由三部分构成，分别为与配体结合的胞外区、跨膜区及胞内区。细胞表面的EGFR与其配体结合可以激活其细胞内的酪氨酸激酶区，从而产生级联反应，促进细胞增殖[2]。有研究证明，NSCLC EGFR基因突变可以持续活化EGFR酪氨酸激酶，促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡[3]。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)可以竞争结合EGFR的胞内部分，直接抑制EGFR酪氨酸激酶，从而阻断EGFR的信号传导，导致肿瘤细胞生长停滞[4]。目前，EGFR-TKI药物(如吉非替尼和厄洛替尼)已经成为临床治疗NSCLC的重要手段。

表2 非小细胞肺癌EGFR、KRAS基因突变类型

表3 64例非小细胞肺癌 EGFR基因突变位点的比较

与EGFR 19号外显子突变率相比，*P<0.01

表4 64例非小细胞肺癌中EGFR、KRAS基因突变与临床病理特征的关系

图1 非小细胞肺癌中EGFR突变测序结果

A.18号外显子点突变2156G>C；B.19号外显子缺失突变2235_2249 del 15；C.20号外显子点突变2369 C>T；D.20号外显子插入突变2307_2308 ins 9；E.21号外显子点突变2573 T>G；F.21号外显子点突变2582T>A

图2 非小细胞肺癌中KRAS基因突变PCR结果 A.GGT>TGT；B.GGT>AGT；C.GGT>GTT；D.GGT>GAT

EGFR突变中最多见的为19号外显子缺失和21号外显子突变，约占突变总数的86%，19号外显子缺失由于突变位点及缺失碱基长度不同使得突变类型较多[5]。本组64例NSCLC中EGFR基因突变率为42.2%，其中19号外显子缺失突变与21号外显子的突变率较高，且19号外显子的突变率明显高于18号外显子。这与上述文献结果相近。栾焕玲等[6]的研究结果发现女性NSCLC患者EGFR基因突变率高于男性，肺腺癌高于肺鳞癌，无吸烟史者高于有吸烟史者。与Paez等[7]的研究结论一致。本组实验结果显示，NSCLC患者中女性、肺腺癌及无吸烟史患者的EGFR突变率分别高于男性、肺鳞癌及有吸烟史患者，这与国内外学者的研究结果一致。通过探讨EGFR基因突变与临床病理特征的关系，有助于筛选EGFR基因检测的人群，为临床提供参考依据。

KRAS蛋白相对分子质量为2.1×104，故也被称为p21蛋白。KRAS蛋白位于细胞膜内面，具有内在GTP酶活性，KRAS蛋白通过与GTP结合后被活化，参与调节细胞的生长、增殖。KRAS基因突变后其编码的p21蛋白活性降低，失去内在GTP酶活性，从而使得信号传导一直处于激活状态，持续刺激细胞生长、发育、增殖，引起细胞恶变[8]。

KRAS基因突变率在人种之间存在差异，西方NSCLC人群中KRAS突变率较高，在肺腺癌中达30%。亚洲NSCLC人群的突变率为4%～24%[9]。KRAS基因突变主要发生于第2外显子的12及13号密码子上，其中12号密码子的突变率(92%)显著高于13号密码子突变率(8%)[10]。本组实验结果显示，NSCLC中KRAS基因突变率为12.5%，均发生在12号密码子，与上述文献结果相符。目前对KRAS基因突变与临床病理特征关系的相关研究结果各异。Xu等[11]研究发现，NSCLC患者的KRAS基因突变检出率男性多于女性，肺腺癌多于其它类型的肺癌，有吸烟史者多于无吸烟史者。而张阳等[12]的研究结果显示KRAS基因的突变在性别之间差异并无统计学意义，也未发现KRAS突变与病理类型、吸烟情况以及分化程度存在相关性。本组实验结果显示，肺腺癌患者的突变率要明显高于肺鳞癌患者，而与患者性别、年龄、有无吸烟史、分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期均无关。该结果与文献报道不完全一致，这种差异可能与KRAS突变率较低所导致的抽样误差有关。

KRAS通路是EGFR活化下游效应的重要信号转导通路之一。突变型KRAS无需接受EGFR信号即可自动活化该通路并启动下游信号的转导，使得NSCLC进展更迅速，并且使KRAS突变患者对分子靶向药物EGFR-TKI发生原发耐药[13]。目前，NSCLC患者EGFR突变与KRAS突变被广泛认为是相互独立的[14]，但本组检出4例肺腺癌患者同时存在EGFR和KRAS基因突变。以上结果提示在同一NSCLC患者中可以同时发生EGFR和KRAS基因突变。有学者研究了6例EGFR-KRAS共突变患者，他们认为存在共突变的肿瘤细胞中，EGFR基因突变在其肺癌的发生中起到主导作用[15]。由于共同突变的发生率较低，研究病例有限，其生物学意义仍需更多临床资料的积累。

[1] 张 丹, 黄 艳, 王红阳. 非小细胞肺癌驱动基因突变及靶向治疗的研究进展[J]. 中国肺癌杂志, 2014,17(10):750-754.

[2] 吴健虹, 谢秋玲, 陈小佳, 洪 岸. 表皮生长因子受体EGFR及其信号传导[J]. 生命科学, 2006,18(2):116-122.

[3] Lynch T J, Bell D W, Sordella R,etal. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. N Engl J Med, 2004,350(21):2129-2139.

[4] 王 芬, 王 洁, 白 桦, 等. 晚期非小细胞肺癌EGFR蛋白磷酸化、基因突变与EGFR-TKI疗效相关性的研究[J]. 中国癌症杂志, 2014,4(9):657-668.

[5] 凌 云, 邱 田, 李 卓, 等. 非小细胞肺癌中EGFR和KRAS基因突变的特点及与临床病理特征的关系[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(5):536-541.

[6] 栾焕玲, 孙蕾娜, 董 娜, 等. 非小细胞肺癌中EGFR和KRAS基因突变与蛋白表达相关性的研究[J]. 中国癌症杂志, 2010,20(7):486-491.

[7] Paez J G, Janne P A, Lee J C,etal. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004,304(5676):1497-1500.

[8] Bos J L. Ras oncogenes in human cancer: a review[J]. Cancer Res, 1989,49(17):1352.

[9] 罗 炜, 王 慧, 徐韫健. 非小细胞肺癌患者KRAS基因突变情况分析[J]. 广东医学, 2014,13(35):2025-2028.

[10] Yu H A, Sima C S, Shen R,etal. Prognostic impact of KRAS mutation subtypes in 677 patients with metastatic lung adenocarcinomas[J]. J Thorac Oncol, 2015,10(3):431-437.

[11] Xu J, He J, Yang H,etal. Somatic mutation analysis of EGFR, KRAS, BRAF and PIK3CA in 861 patients with non-small cell lung cancer[J]. Cancer Biomark, 2011,10(2): 63-69.

[12] 张 阳, 潘振奎, 张 星, 等. 非小细胞肺癌患者KRAS基因突变的研究[J]. 中国肺癌杂志, 2010,13(6):602-606.

[13] Timar J, Hegedus B, Raso E. KRAS mutation testing of colorectal cancer for anti-EGFR therapy: dogmas versus evidence[J]. Current Cancer Drug, 2010,10(8):813-823.

[14] 王 琼, 吕亚莉,钟 梅, 等. 非小细胞肺癌中EGFR和KRAS基因突变检测分析与病理特征的关系[J]. 诊断病理学杂志, 2012,19(2):144-147.

[15] Lee L, Lee B, Choi Y L,etal. Non-small cell lung cancer with concomitant EGFR, KRAS, and ALK mutation: clinicopathologic features of 12 cases[J]. J Pathol Transl Med, 2016,50(3):197-203.

Relation of EGFR and KRAS gene mutations with its pathological characteristics in non-small cell lung cancer

WANG Shan, DONG Li-ru, LIU Ai-dong, XIONG Yan-jie, REN Hui-qiang, SONG Xu-dong
(DepartmentofPathology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan063000,China)

Purpose To investigate the relation of EGFR and KRAS gene mutations with the pathological characteristics in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The EGFR and KRAS gene mutations were detected and analyzed in 64 patients with NSCLC by capillary electrophoresis and fluorescent probe method. Results In 64 cases, the EGFR gene mutations were detected in 27 patients (42.2%); the KRAS gene mutations in 8 patients (12.5%). The EGFR and KRAS mutations synchronized in 4 patients (6.25%). The mutations rate of EGFR was related to gender, histology type and smoking condition (P<0.05). There was no association between mutation of EGFR gene with the age, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The mutations rate of KRAS gene was higher in adenocarcinoma patients than that in squamous carcinoma (P<0.01). There was no relationship between mutation of KRAS gene with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). Conclusion In NSCLC, EGFR gene mutations rate is higher than KRAS gene mutation. The mutation rate of EGFR gene is higher in female, adenocarcinoma and never smokers; the mutations rate of KRAS mutations is higher in patients with adenocarcinoma. The mutations in EGFR and KRAS can exist at the same time.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; EGFR; KRAS; gene mutations

河北省临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目(361036)

华北理工大学附属医院病理科，唐山 063000

王 珊，女，硕士研究生。E-mail: 496874845@qq.com 宋旭东，男，教授，主任医师，硕士生导师，通讯作者。E-mail: songxd2002@sina.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.006.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)04-0379-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.006

接受日期：2017-02-20