醋酸丙氨瑞林对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤的作用及其对TRF1表达的影响〔1〕

李红梅，张三元，赵文英，范静静

(1.山西省妇幼保健院，山西 太原 030012；2.山西医科大学第一医院，山西 太原 030001；3.山西省人民医院，山西太原 030012)

醋酸丙氨瑞林对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤的作用及其对TRF1表达的影响〔1〕

李红梅1，张三元2，赵文英1，范静静3

(1.山西省妇幼保健院，山西 太原 030012；2.山西医科大学第一医院，山西 太原 030001；3.山西省人民医院，山西太原 030012)

目的：探讨不同剂量的醋酸丙氨瑞林对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及TRF1的表达情况。方法：采用HEC-1-B细胞成功建立人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，选取34 只雌性荷瘤裸鼠随机分为四组：对照组、低剂量醋酸丙氨瑞林组(20 μg/kg)、中剂量醋酸丙氨瑞林组(40 μg/kg)、高剂量醋酸丙氨瑞林组(80 μg/kg)。观察裸鼠生长发育情况，每7天测量皮下移植瘤体积，4 周后处死裸鼠，取出移植瘤，测量肿瘤体积，计算抑瘤率。移植瘤组织石蜡包埋行苏木素-伊红(HE)染色，镜下观察瘤细胞形态变化。免疫组织化学法检测各组瘤组织中端粒重复因子1(TRF1)的表达情况。结果：低、中、高醋酸亮丙瑞林组的抑瘤率逐渐增高，分别为15.03%、21.80%及39.98%，各组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色后干预组瘤细胞排列较对照组稀疏，瘤细胞核深染、固缩。随着药物剂量增加，免疫组织化学检测到瘤组织中TRF1表达下调，各干预组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：醋酸丙氨瑞林对子宫内膜癌细胞株HEC-1-B裸鼠皮下移植瘤生长有抑制作用，可能与TRF1蛋白表达下调有关。

子宫内膜癌；丙氨瑞林；裸鼠移植瘤；端粒重复因子1(TRF1)

子宫内膜癌(EC)是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，多数为腺癌，发病率呈逐年上升趋势，但其发病机制仍不明确，趋于年轻化。复发、晚期以及有严重合并症的患者，常常需要辅助以药物治疗(化学药物、激素)和放疗[1]。其中，激素治疗因其安全性高的特点受到研究者的青睐，其中促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)的应用备受关注。GnRHa在一些激素依赖性的肿瘤中已进入到临床应用阶段，如乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌[2]。本实验通过建立动物模型，观察不同剂量的丙氨瑞林对肿瘤生长及对TRF1表达的影响，推断促性腺激素释放激素(GnRH)可能的抑癌机制，为GnRHa在临床应用提供理论及实验依据。

〔1〕本课题为山西省科技厅自然科学基金项目(项目编号：2013011045)

1 材料与方法

1.1 实验材料

雌性裸鼠34 只，4～6 周龄，购自中国药品检验所实验中心，无菌条件下饲养；子宫内膜癌HEB-1B细胞株(细胞株表面含有ER、PR、GnRH-R)；丙氨瑞林购自马鞍山丰源制药有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HEC-1-B细胞培养

将对数期的HEC-1-B细胞株置于高糖培养基，待细胞融合时胰蛋白酶传代，制备成浓度为5.0×107/mL的悬浊液。

1.2.2 移植瘤动物模型

HEC-1-B子宫内膜癌细胞株悬浊液0.2 mL(约含8×106个细胞)注射于裸鼠的左前肢。建模成功的标志为接种处出现粟粒结节。

1.2.3 实验分组

34 只裸鼠，去除移植瘤结节最大及最小的2 只，并将剩余的32 只随机分四组：对照组、低剂量醋酸丙氨瑞林组(20 μg/kg)、中剂量醋酸丙氨瑞林组(40 μg/kg)、高剂量醋酸丙氨瑞林组(80 μg/kg)。按剂量分组饲养，每日给予肌肉注射0.2 mL注射液1 次，观察28 d后处死裸鼠，取出位于左前肢的皮下移植瘤结节。测量瘤体的长、宽、高，计算瘤体的体积(V)。计算抑瘤率(IR)=[(V对照组)-(V实验组)/V对照组]×100%。抑瘤率大于10%为药敏阳性。

1.2.4 TRF1蛋白表达检测

移植瘤细胞中TRF1蛋白主要在胞核内表达。病理图像分析软件分析各组阳性灰度值，取平均数后进行统计学分析。

1.2.5 统计学方法

2 结 果

2.1 不同剂量丙氨瑞林干预后瘤体的变化

按照试验步骤，给予不同剂量的丙氨瑞林干预后，随着丙氨瑞林剂量的增加，肿瘤体积逐渐减小。计算各组的抑瘤率均>10%，将各剂量组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。表明丙氨瑞林可以抑制移植瘤的生长。

2.2 瘤体的细胞学改变

对照组移植瘤组核异型性明显，染色较深；各丙氨瑞林组细胞核大小不一，形态不规则，瘤细胞变小、破碎、坏死，细胞间排列较前明显稀疏，局部区域可见片状无结构的坏死区。

表1 不同剂量药物对裸鼠移植瘤生长的影响

2.3 丙氨瑞林与TRF1表达的关系

免疫组织化学法处理后，TRF1蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒，主要位于胞核中。通过病理图像分析进行半定量分析，以图片中目标的灰度值反应其表达情况。随着丙氨瑞林剂量增大，TRF1灰度值增高。对照组平均灰度值为103.00±6.87，低剂量醋酸丙氨瑞林组灰度值为132.19±7.53，中剂量醋酸丙氨瑞林组灰度值为154.28±6.93，高剂量醋酸丙氨瑞林组灰度值为171.52±10.91。各剂量组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。各剂量组免疫组化结果见图1～图4。

图1 对照组免疫组化结果

图2 低剂量醋酸丙氨瑞林组免疫组化结果

图3 中剂量醋酸丙氨瑞林组免疫组化结果

图4 高剂量醋酸丙氨瑞林组免疫组化结果

3 讨 论

促性腺激素释放激素类似物(GnRH-α)是一种模拟天然GnRH效应的九肽类似物，其活性是天然GnRH的十倍甚至百倍，丙氨瑞林为其中一类。对GnRH的依赖性肿瘤细胞具有阻碍增殖的作用，主要是依靠阻碍性腺轴和垂体的功能来发挥的作用，少数情况下是依靠肿瘤细胞局部的自分泌以及旁分泌的调整来完成，即间接抑制下丘脑-垂体-性腺轴或直接与肿瘤细胞表面的GnRH受体结合。位于哺乳动物染色体末端的端粒是由重复的DNA序列TTAGGG和蛋白组成，其中的部分蛋白按照一定的顺序结合形成端粒保卫蛋白复合体(Shelterin)。Shelterin属于端粒蛋白的一种，有6 种蛋白组成，分别为Rap1、TIN2、POT1、TRF1、TPP1及TRF2。在端粒中，这6 种独立的蛋白组装起来与重复的碱基序列一道，形成复杂的双链结构。这样复杂的DNA-蛋白结构可以使得染色体末端得到保护，并可以确保基因的稳定性，避免了DNA损伤性的应答[3-4]。然而，这些组成成分中的任一部分发

生结构或功能的异常就有可能引起不良的DNA损伤应答，甚至细胞衰老或凋亡。TRF1于1995年被chong等首次发现[5]。TRF1的表达主要位于胞核中，由三个重要的结构域，分别为：TRF特异性结构域、羧基末端的myb样DNA结合结构域、氨基末端的酸性结构域。在端粒的长度调控方面，TRF1发挥负性作用。TRF1以二聚体的形式通过其C端的myb结构域与端粒DNA结合，促进端粒末端的三级环状结构T-Loop的形成，与TRF2一起参与维持基因组的稳定性。当TRF1启动ATM磷酸化，可参与DNA的损伤响应系统，增加细胞的癌症易感性。陈炜等[6]研究表明，在前列腺癌中TRF1蛋白的表达水平位于胞核，且明显高于前列腺增生组织。但Aragona等[7]对颅内肿瘤的研究中发现TRF1在胞浆明显表达，在正常组织、良性肿瘤中表达高于恶性肿瘤组。本实验在建立裸鼠皮下移植瘤模型后，移植瘤在不同剂量的丙氨瑞林组中有变化。随着丙氨瑞林剂量增加，裸鼠移植瘤的体积降低，与本课题结果一致，且丙氨瑞林剂量的增加，TRF1表达的下降，可以推测丙氨瑞林对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用，可能是通过下调TRF1来实现的。但是丙氨瑞林抗肿瘤的机制尚未被完全揭示，有可能是多种机制共同作用的结果，希望随着GnRH抑制肿瘤作用机制的研究深入，可以被更好地应用于临床。

[1]谢幸，苟文丽，林仲秋，等.妇产科学[M].8版.北京：人民卫生出版社，2013：313-314.

[2]ROSE P G.Medical progress，endometrial carcinoma[J].N Engl J Med，1996，335 (9)：640-648.

[3]HOU L，JOYCE B T.Blood telomere length attrition and cancer development in the norm-ative aging study cohort[J].EBio Medicine 2015，2(6)：591-596.

[4]MEENA J，RUDOLPH K L，GUNES C.Telomere dysfunction instability and cancer[J].Recent Results Cancer，2015，200：61-79.

[5]CHONG L.A human telomeric protein[J]，Science，1995，70(5 242)：1 663-1 667.

[6]陈炜，何丽娜，王勇.端粒重复序列结合蛋白TRF1及TRF2在前列腺癌中的表达及临床意义[J].临床泌尿外科杂志，2016，31(9)：841-845.

[7]ARAGONA M，DEDIVITIIS O，LATORRE D，et al.Immunohistochemical TRF1 expressionin human primaryintracranialtumors[J].Anticancer Res，2001，21(3C)：2 135-2 139.

(本文编辑：张红)

Effection of alarelin on subcutaneous xenograft growth of humanendometrial carcinoma in nude mice and expression of TRF1

LI Hongmei1，ZHANG Sanyuan2，ZHANG Wenying1，FAN Jingjing3

(1.Shanxi Maternal and Child Health Hosipital，Taiyuan 030000，China；2.First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China；3.Shanxi Provincial People′s Hosipital，Taiyuan 030012，China)

Objective：To explore the effect of intervention with Alarelin on telomeric repeat binding factor-1(TRF1) expressions in endometrial cancer and subcutaneously xenografted tumor in nude mice.Methods：Endometrial cancer cell line HEC-1-B cultured in vitro was inoculated into subcutaneous tissue of nude mice to establish xenograft tumor model.34 female nude mice were randomly divided into control group(normal saline)，different dose group(20 μg /kg，40 μg /kg，80 μg /kg).During the period of treatment，our group members measured the size and volume of tumor every seven days.After four weeks，we were removed the xenograft tumor and calculate the volume of tumor.The changes of xenograft morphology were observed by light microscopy with Hematoxylin-easin(HE) staining，and the change of TRF1(TRF1) expressions were estimated by immunohistochemical technology.Results：Alarelin inhibited the tumor growth by 15.03%，21.80%，39.98%，in difference alarelin groups，and the difference was significant between the groups(P<0.05).The hematoxylin-easin staining results showed significant changes.With the increase of alarelin，the expression of TRF1 is decreased.Conclusion：Alarelin have direct inhibitory effect on nude mice who bearing human endometrial carcinoma，which may be associated with the decreased expression of TRF1 protein.

endometrial carcinoma；alarelin；transplanted tumor in nude mice；telomeric repeat binding factor-1

陈世雄(1982— )，男，江西省九江市人，学士学位，主治医师，主要从事胸外科常见病多发病的诊治工作。

1671-8631(2017)05-0361-03

R737.3

A

2016-12-12

基础医学