大鼠腹主动脉瘤中早期生长反应因子1mRNA表达水平的研究①

董海鹏，王 石，刘程伟，徐桂超，金 松

(佳木斯大学附属第一医院血管外科，黑龙江 佳木斯 154003)

大鼠腹主动脉瘤中早期生长反应因子1mRNA表达水平的研究①

董海鹏，王 石，刘程伟，徐桂超，金 松

(佳木斯大学附属第一医院血管外科，黑龙江 佳木斯 154003)

早期生长反应因子-1；腹主动脉瘤；q-PCR

早期生长反应因子-1 (Earlygrowthresponse1，Egr-1)是重要的核转录因子。在调控细胞的生长、分化、发育、增殖、炎性反应等方面发挥重要作用，并且参与多种动脉疾病的发生和发展[1,2]。本研究旨在建立大鼠腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm，AAA)灌注模型的基础上，应用q-PCR技术检测Egr-1在正常动脉及动脉瘤组织中的表达，以探讨其在腹主动脉瘤发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型

雄性SD大鼠20只(辽宁长生生物技术有限公司提供)，体重250～300g，动物随机分为2组：对照组(正常大鼠腹主动脉)，实验组(弹力蛋白酶灌注)，每组10只。所有的动物都根据中国现行法律对实验动物的护理及保护原则进行试验。大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg，腹腔注射)，然后固定在手术台上。切开皮肤及腹壁各层，显露游离肾下腹主动脉和下腔静脉，于左肾静脉下方游离长约1cm的腹主动脉主干，与左肾动脉开口下方阻断血流，经左侧髂总动脉插入导管直至腹主动脉上部，结扎腹主动脉分叉上方使其成为一个内含导管的密闭管腔，灌注1mL(20u)弹力蛋白酶持续灌注 30min。14d后收集标本，将标本剪碎放入1mLTrizoL并放入-80℃中保存。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应

取灌注后的腹主动脉用Trizol试剂提取总RNA(Invitrogen)，测定RNA的纯度及浓度用NanoDrop1000 (NanoDrop,Wilmington,DE)。用PrimeScriptTMRT试剂盒，将样品总RNA逆转录成cDNA。实时定量逆转录聚合酶链反应采用SYBRGreenPCRMasterMix(takara)在ABI7500Real-TimePCRSystem(AppliedBiosystems)中进行实时定量。循环参数如下：95℃变形30s，95℃ 5s，60℃ 30s顺序循环40次。在PCR中使用的引物 ，Egr-1引物：上游引物5’-CAGGAGTGATGAACGCAAGA-3’,下游引物5’-GGGGATGGGTAGGAAGAGAG-3’；β-actin引物：上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。测定目标基因的表达，以β-actin为内参，用2-△△CT法测定目标基因的表达。每个样本做三次独立重复试验。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠腹主动脉瘤模型的建立

腹主动脉瘤是指腹主动脉呈瘤样扩张，通常直径增大50%以上定义为动脉瘤。根据测量腹主动脉直径得出实验组动物模型均已达到腹主动脉瘤诊断标准(对照组：1.400±0.033, 实照组：2.950±0.171,每组10只，P<0.05)。见图1。

2.2Egr-1mRNA的表达在腹主瘤中表达升高

可以看出在腹主动脉瘤组中Egr-1mRNA的表达水平明显升高，而正常腹主动脉中Egr-1mRNA的表达很低(对照组：1.026±0.122, 实验组：6.177±0.721，P<0.05)。见图2。

图1 大鼠灌注前后腹主动脉瘤的直径注：对照组为正常腹主动脉直径，实验组为灌注后14d直径P<0.05。

图2 q-PCR检测 Egr-1 mRNA的表达

注：对照组和实验组(弹力蛋白酶灌注组)(P<0.05)。

3 讨论

腹主动脉瘤(AbdominalAorticAneurysm,AAA)的发生发展过程一直是血管外科研究的重点内容之一。许多学者根据近年来对腹主动脉瘤发病机理的认识,想通过建立实验动物模型,诱导产生与人类腹主动脉瘤形成机理相似的动物模型,对其发病原因、发病机理等表现进行进一步研究,并进一步探索药物预防及治疗的方法。1990年Aindjar[3]等研究发现人腹主动脉瘤组织中弹力蛋白明显减少,从而创立了大鼠肾下腹主动脉加压灌注弹力蛋白酶的方法,建立腹主动脉瘤动物模型。因其具有与人类腹主动脉瘤形成有相似的发病机制和病理特点,现已被广泛接受。弹力蛋白酶灌注腹主动脉瘤的特点是主动脉壁的炎症反应炎并产生大量促炎细胞和因子如巨噬细胞，肿瘤坏死因子(TNF-α)[4]，白细胞介素1(IL-1b),转换生长因子(TGF-b)，基质金属蛋白酶[5]等。中层平滑肌细胞减少[6]，细胞外基质的破坏和降解导致动脉管腔逐渐扩张。

早期生长反应因子1，是一种锌指状的早期转录因子。Egr-1 参与多种病理生理过程如细胞增殖、分化及凋亡[7]，炎症反应[8]、血栓形成、细胞外基质的合成与降解等。我们的研究结果表明Egr-1mRNA在腹主动脉瘤中表达升高，可能是Egr-1参与调节炎症反应，细胞外基质降解，平滑肌细胞的迁移等。Harja[9]研究表明不同周龄的apoE-/-小鼠血管壁中Egr-1表达情况，而Egr-1的下游炎症因子的表达也同步上调。此外，apoE、Egr-1双敲除小鼠血管壁中炎性因子明显减少，提示Egr-1 可能通过调控其下游炎症基因的表达而影响AAA的发生和发展。多种因素可以刺激内皮细胞Egr-1 表达上调，不仅促进内皮细胞自身的增殖分化及迁移，还促使细胞分泌基质金属蛋白酶，而细胞增殖分化和迁移也会破坏血管壁正常结构促进腹主动脉瘤的形成。Egr-1还能够激活MMP-2，与MT1-MMP的表达相关，Egr-1可以结合到MT1-MMP的结合位点[10]，这些因子的表达都受Egr-1的调控，而MMP在细胞外基质的破坏，降解和炎症反应中起重要作用[11]，尤其是基质金属蛋白酶2(MMP-2)[12]和基质金属蛋白酶9(MMP-9)[5]。这些因素都可能促进腹主动脉瘤的形成。

本实验证实，Egr-1mRNA在大鼠腹主动脉瘤中大量表达使Egr-1成为参与腹主动脉瘤的发生发展过程，说明其与腹主动脉瘤的发病机制密切相关，使Egr-1成为防治AAA的新靶点，但其通过何种机制发挥作用，尚需进一步探讨。

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Expression of early growth response factor-1 mRNA in rat abdominal aortic aneurysm (AAA) pathogenesis

DONGHai-peng,WANGShi,LIUCheng-wei,XUGui-chao,JINSong

(Department of Vascular Surgery，The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Egr-1; abdominal aortic aneurysm; Quantitative real-time polymerase chain reaction (q-PCR)

1.国家自然科学基金 ，编号：30801123, 81070254；2.教育部留学回国人员科研启动基金，编号：教外司留【2014】1685 号。

董海鹏(1990～)男，黑龙江尚志人，在读硕士研究生，医师。

刘程伟(1976～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师。E-mail：liucwcw@163.com。

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1008-0104(2017)02-0001-02

2016-07-20)