黄连乙醇提取物与盐酸小檗碱体外抗炎对比研究①

陈 凯 王月亮 王佳奇 丁传波 宋明铭 刘文丛 郑毅男 李 慧

(吉林农业大学中药材学院，长春130118)

·中医中药与免疫·

黄连乙醇提取物与盐酸小檗碱体外抗炎对比研究①

陈 凯②王月亮②王佳奇 丁传波 宋明铭 刘文丛 郑毅男 李 慧②

(吉林农业大学中药材学院，长春130118)

目的：比较黄连乙醇提取物与盐酸小檗碱体外抗炎活性，探索体外抗炎机制。方法：通过脂多糖体外刺激小鼠单核巨噬细胞建立细胞炎症模型，给药干预后，LPS长时间刺激RAW264.7细胞，MTT比色法分析黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱对RAW264.7细胞生长活性的影响。酶联免疫吸附法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2)含量。实时荧光定量RT-PCR法检测iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达。结果：在5～80 mg/L范围内，黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱对RAW264.7细胞无抑制作用；各浓度给药组IL-6、IL-1β、TNF-α、NO、前列腺素E2 (PGE2 )含量与LPS刺激模型组比较均有显著性(P<0.01)，且浓度与剂量无效应相关。实时荧光定量RT-PCR结果显示，各浓度给药组均明显降低iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且与浓度不呈效应关系。结论：黄连乙醇提取物具有体外抗炎作用，抗炎活性优于盐酸小檗碱，其作用机制可能与抑制TNF-α、NO等炎症因子的活化，进而影响花生四烯酸(AA)代谢有关。

黄连乙醇提取物；RAW264.7细胞；炎性因子；荧光定量

黄连为毛莨科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsial ) 或云连(Coptisteeta Wall.) 的干燥根茎，在我国西南和中南山区分布广泛，具有清热燥湿，泻火解毒等功效。黄连的主要成分是原小檗碱型化合物，包括小檗碱、表小檗碱、黄连碱、药根碱及巴马汀。在分子结构特点上均属异喹啉类生物碱，具季铵基团，就抗炎方面，黄连单味药及其组成成分之一的名方三黄泻心汤具有较好的疗效[1-4]。目前研究表明，黄连中抗炎作用的主要活性成分为盐酸小檗碱，此外，也有相关数据显示，黄连提取物有很好的抗炎作用[5]。因此，本研究选择广泛应用于体外实验的小鼠巨噬细胞系细胞(RAW264.7细胞)，用脂多糖(LPS)诱导，建立巨噬细胞炎症模型，观察盐酸小檗碱及黄连提取物对诱导的小鼠巨细胞释放炎性细胞因子影响，以及iNos、HO-1 和TNF-α mRNA表达，比较二者的抗炎活性，探讨其体外抗炎作用机制，为拓展黄连的药用范围及推动抗炎新药的研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 RAW264.7 细胞(中科院上海细胞研究所)，RPMI1640培养基、DMEM培养基(Hyclone)，胎牛血清(康源)，青霉素及链霉素混合液(上海铭博生物科技有限公司)，脂多糖(LPS，Sigma)，地塞米松(广东三才石岐制药股份有限公司)，黄连药材饮片(河北安国市昌达中药材饮片有限公司)，盐酸小檗碱对照品(110713-201206，中国食品药品检定研究院，纯度98%)，IL-6 ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒、NO ELISA试剂盒、PGE2 ELISA试剂盒均购自R&D公司，RT试剂盒、RCR试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，MTT(amresco)，磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)，引物由北京博仕生物有限公司设计。

1.1.2 仪器 超净工作台(美国Forma公司)，CO2培养箱(美国Forma公司)，倒置显微镜(上海利鑫坚离心机有限公司)，冷冻离心机(上海比目仪器有限公司)，酶标仪(美国AWARENS)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RAW264.7 细胞在37℃，5% CO2条件下，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 U/ml)的DMEM培养液中传代培养，试验用细胞均处于对数生长期。

1.2.2 黄连乙醇提取物制备 取黄连饮片适量，加入15倍体积的50%乙醇溶液，超声提取3次，每次30 min，合并滤液，旋转蒸发浓缩至一定体积后，干燥，即得。

1.2.3 抗炎活性与机制研究

1.2.3.1 MTT法检测不同浓度给药组对RAW2 64.7细胞生长的影响 取对数生长期的RAW2 64.7 细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用含10%的PBS的DMEM培养基制成1×105个/ml单细胞悬液，以每孔100 μl接于96孔板中，每一浓度6个复孔。于37℃，5% CO2培养孵育24 h，分别加入5、10、20、40、80 mg/L的黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培养，继续培养24 h。弃上清液，用10% PBS洗3次，每孔加入180 μl DMEM和20 μl MTT(0.5 g/L)后，加入不同浓度的黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱(5、10、20、40、80 mg/L)，弃培养液，每孔换无血清RPMI1640培养液195 μl，再加入 5 g/L MTT 10 μl，于37℃、5%CO2，培养4 h，吸出培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡5 min，采用自动酶标仪在570nm波长检测OD值，以此反映细胞活力。细胞存活率(%)=[1-(A空白对照组-A药物组)/A空白对照组]×100%。

1.2.3.2 LPS诱导RAW264.7细胞对IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量的影响 调整RAW264.7细胞悬浊液浓度为1×105个/ml，以每孔100 μl接于96孔板中，待细胞贴壁后，设空白对照组，LPS刺激模型组，地塞米松阳性对照组，黄连乙醇提取物给药组(5、10、20、40、80 mg/L)及盐酸小檗碱给药组(5、10、20、40、80 mg/L)，每组6个复孔。空白对照组只加入DMEM培养基，LPS刺激模型组加入1 mg/L LPS刺激培养，地塞米松阳性对照组加入2 mg/的地塞米松预处理2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培养，给药组分别加入5、10、20、40、80 mg/L两组药物预处理2 h后，加入1 mg/L LPS刺激培养。继续培养24 h，收集上清，ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量。操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.3.3 LPS诱导RAW264.7细胞iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达影响 实时荧光定量RT-PCR法检测iNos、HO-1、TNF-α mRNA基因表达。细胞干预4 h后提取RNA，细胞总RNA提取采用RT试剂盒提取法，具体方法参照说明书。将RNA保存在-80℃备用。采用ABI-7700序列检测仪。

引物序列为Mus-iNos:Forward：5′-AAGTCCAGCCGCACCACCCT-3′，Reverse：5′-CCTCGCTCA-ACACCTAAC-3′；Mus-TNF-α：Forward：5′-GGCGGTGCCTATGTCTCA-3′，Reverse：5′-AGTCAAGATACCGGGTCTG-3′，Mus-HO-1:Forward：5′-CCCCACTCTACTTCCCTG-3′，Reverse：5′-GATACATTTCGCA-GAGGTGC-3′;Mus-Cyclophilin：Forward：5′-GCAA-AGACACCAATGGCTCA-3′，Reverse：5′-CGTGGTTC-TGTCTGTCGG-3′。

2 结果

2.1 不同浓度给药组对RAW264.7细胞生长的影响 MTT结果显示：黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱给药浓度在5～80 mg/L范围内，镜下观察细胞形态均无改变，各浓度给药组吸光度与对照组比较，OD值差异无显著性，黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱内无细胞毒性。

2.2 LPS诱导RAW264.7细胞对IL-1β、IL-6、NO、TNF-α、PGE2含量的影响 结果显示，LPS模型组TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量明显高于对照组(P<0.01)，表明LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型造模成功。与模型组相比，两种药物各个给药组中TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量均显著降低(P<0.01)，给药浓度 5～20 mg/L时，炎症细胞所释放的各个因子含量，均随浓度的升高而降低；给药浓度20～80 mg/L时，炎症细胞所释放的各个因子含量，随浓度的升高而升高；说明各炎性因子含量与浓度无效应关系。黄连乙醇提取物的抑制作用优于盐酸小檗碱，浓度为20 mg/L的两种药物给药组对各个因子的抑制作用均最为显著(P<0.01)，均能减少炎症细胞所释放的TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量，见表 1。

2.3 LPS诱导RAW264.7细胞iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达影响 结果显示，与对照组比较，LPS刺激后巨噬细胞均增加(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，两种药物给药浓度20 mg/L组iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达均显著降低(P<0.01)，其他给药浓度组iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达均降低(P<0.05)，两种药物对iNos、HO-1、TNF-α mRNA的mRNA表达的抑制作用无显著性差异，见表2。

表1 TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量

Tab.1 Concentration of TNF-α，IL-6，NO，IL-1β，PGE2

GroupsContent(ng/L)TNF-αIL-6NOIL-1βPGE2Blankgroup82.98±4.7224.55±1.303.43±0.364.97±0.1781.71±2.29Modelgroup183.50±2.381)52.34±1.351)16.93±0.511)17.24±0.401)351.30±13.041)Positivecontrolgroup96.83±2.352)30.62±1.662)6.71±0.442)7.83±0.262)111.71±4.722)Berberinehydrochloridegroup5mg/L181.76±1.482)49.65±1.252)16.78±0.862)17.80±0.522)287.99±6.332)10mg/L155.88±4.792)44.79±1.982)14.52±0.652)15.97±0.632)259.26±2.892)20mg/L123.42±6.532)39.71±0.672)11.27±0.982)12.12±0.442)199.65±3.462)40mg/L146.55±5.492)41.97±0.652)13.39±0.712)13.79±0.582)232.58±5.422)80mg/L152.46±6.772)43.89±0.682)14.25±0.992)14.89±0.552)248.42±5.912)EthanolextractcoptischinensisFranch.group5mg/L173.45±1.642)45.37±1.322)14.80±0.622)14.60±0.522)243.14±7.412)10mg/L144.07±5.312)40.90±2.092)11.92±0.572)13.67±0.862)220.78±3.012)20mg/L107.36±7.082)34.70±0.822)9.68±0.672)10.51±0.652)167.30±3.812)40mg/L131.36±5.752)38.80±0.872)11.36±0.672)11.52±0.882)201.40±6.012)80mg/L141.88±7.902)40.60±0.892)12.16±1.032)11.63±0.422)217.19±5.592)

Note：Compared with blank group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

表2 iNos、HO-1、TNF-α mRNA表达量

Tab.2 Expression of iNos,HO-1,TNF-α mRNA

GroupsiNosHO-1TNF-αBlankgroup20.59±1.9745.77±3.5513.44±1.21Modelgroup110.30±11.531)243.30±18.971)77.29±5.681)Positivecontrolgroup81.71±6.822)131.71±10.562)41.44±3.272)Berberinehydrochloridegroup5mg/L101.32±7.422)201.56±12.862)60.55±3.672)10mg/L89.66±5.622)168.39±8.272)53.19±2.022)20mg/L61.29±3.602)130.02±8.042)39.08±2.362)40mg/L94.81±6.182)188.28±11.912)57.42±2.952)80mg/L105.82±7.492)216.39±12.772)67.84±3.612)EthanolextractcoptischinensisFranch.group5mg/L90.14±7.552)183.53±13.242)56.29±3.962)10mg/L72.78±5.292)141.28±9.772)49.47±2.472)20mg/L57.30±3.782)107.37±7.982)33.77±2.012)40mg/L89.40±7.392)170.10±12.552)52.85±3.222)80mg/L97.19±8.022)193.19±13.962)61.28±4.192)

Note：Compared with blank group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

3 讨论

巨噬细胞在炎性反应中起着至关重要的作用，机体被刺激产生炎性反应后，巨噬细胞产生大量的炎性因子及炎性介质，如TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2等。这些炎症因子及介质激活是炎症反应的关键过程，对它们的抑制作用常常作为评价药物抗炎活性的重要指标[6-8]。本研究以LPS诱导RAW 264.7细胞建立炎症细胞模型，体外对比黄连乙醇提取物与盐酸小檗碱的抗炎活性，并探索其作用机制。

正常情况下，静止的巨噬细胞仅产生极少量的炎症因子，当巨噬细胞经LPS、炎症因子等诱导活化后通过一系列信号转导通路，表达大量炎症靶基因，如iNos、HO-1和TNF-α等，从而产生大量IL-6、IL-1β、NO、PGE2和TNF-α，活化后产生的一系列炎症介质推动炎症的级联瀑布反应。TNF-α在级联反应中属于末期的效应分子，也是炎症中起正反馈调控的一个关键分子，参与多种局部和全身的炎症反应[9]。NO 产生受iNos影响，其在体内广泛参与多种生理和病理过程，如调节血管张力、参与神经传递、介导炎症反应和免疫反应等，同时也是炎症和细胞毒素血症中细胞毒性因子[10]。PGE2是一种重要的炎症介质，是花生四烯酸环氧合酶(COX-2)代谢产物，能介导炎症反应中疼痛和发热的产生。所以本研究采用TNF-α、IL-6、NO、IL-1β、PGE2含量变化及TNF-α、iNos和HO-1 mRNA表达作为评价黄连乙醇提取物抗炎效应的标准。

本研究结果显示，黄连乙醇提取物及盐酸小檗碱各个浓度给药组对各炎症因子有不同程度的抑制作用，给药浓度为20 mg/L的抑制作用最为显著(P<0.01)，能明显抑制巨噬细胞释放NO、IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α，其他给药组对各炎症因子的释放也均有不同程度的抑制作用，且各炎症因子的含量与给药浓度无效应关系。在对照组中iNos、HO-1和TNF-α的基因水平都低表达，但经LPS刺激后mRNA表达均上调。与模型组相比，各个浓度给药组对iNos，HO-1 和TNF-α的mRNA 表达均有抑制作用，20 mg/L的给药组iNos、HO-1 和TNF-α的mRNA 表达抑制作用最为显著。其他给药组对各炎症因子mRNA表达也均有不同程度的抑制作用。说明黄连乙醇提取物都具有一定程度的抗炎作用。

黄连提取物通过降低iNos、HO-1和TNF-α mRNA表达抑制NO、PGE2和TNF-α生成，而起到抗炎作用。据文献报道，细胞毒性物质LPS、前炎症细胞因子(TNF-α和PGE2等) 可通过激活巨噬细胞使NF-κB 活化并从细胞质易位到细胞核，启动多种炎症基因如炎症酶(如iNos和HO-1等) 和细胞因子(如TNF-α)表达。该黄连乙醇提取物抑制炎症介质的生成而实现抗炎效应是否在一定程度上影响NF-κB需要进一步研究。综上所述，黄连乙醇提取物具有一定的抗炎作用，且抗炎活性优于盐酸小檗碱，其发挥抗炎作用的机制可能与其影响炎症介质的基因表达有关。本研究为进一步探讨黄连乙醇提取物的抗炎机制提供了实验依据。

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[收稿2016-04-15 修回2016-06-20]

(编辑 张晓舟)

Comparison of anti-inflammatory activity of ethanol extract of coptis chinensis Franch.and Berberine hydrochloride in vitro

CHENKai,WANGYue-Liang,WANGJia-Qi,DINGChuan-Bo,SONGMing-Ming,LIUWen-Cong,ZHANGYi-Nan,LIHui.

JilinAgriculturalUniversityCollegeofTraditionalChineseMedicine，Changchun130118，China

Objective:To study the anti-inflammatory effect of the ethanol extract of Coptis chinensis Franch.in vitro.Methods: An inflammatory cell model was established by stimulating the mouse peritoneal macrophages in vitro with lipopolysaccharide(LPS).LPS stimulated of RAW264.7 cells for a long time after administration of intervention.Effect of ethanol extract of Coptis chinensis Franch.on RAW264.7 cell growth activity was analyzed by MTT assay.The production of tumor necrosis factor-α(TNF-α),IL-1β,IL-6,NO,prostaglandin E2(PGE2) was determined by ELISA.The expression of mRNA of TNF-α，induced nitric oxide synthase(iNos) and HO-1 was detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-PCR).Results: The ethanol extract of Coptis chinensis had no inhibition effect on the scope of RAW 264.7 cells the scope of 5-80 mg/L.Each treatment group concentration of interleukin-6 (IL-6),interleukin-1β (IL-1β),TNF-α,NO,prostaglandin E2 (PGE2) content of LPS stimulation model group were significantly (P<0.01),and content was not related to concentration.Real-time quantitative (RT-PCR) showed,the concentration of each treatment group were significantly lower iNos,HO-1 and TNF-α mRNA expression (P<0.05,P<0.05,P<0.01),and content was not related to concentration.Conclusion: Coptis chinensis Franch.ethanol extract has anti-inflammatory effects in vitro,the mechanism may be related to inhibition of TNF-α,NO and other inflammatory factors and the impact of the activation of arachidonic acid (AA) metabolism.

Ethanol extract of Coptis chinensis Franch.；RAW264.7 cell；Inflammatory cytokines；RT-PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.010

①本文为2009年中医药行业科研专项(200907001-5)、国家科技部科技型中小企业技术创新基金项目(13C26212201221)和吉林省科技发展计划项目(20150311050YY)。

陈 凯(1989年-)，女，在读硕士，主要从事中药制剂评价与新药研发研究。

及指导教师：刘文丛(1968年-)，男，博士，教授，主要从事中药新药研究与开发研究，E-mail:jwlw6803@126.com。

R943

A

1000-484X(2017)05-0684-04

②中国中医科学院中药研究所，北京100700。