电针对卵巢摘除大鼠E2水平及相关受体表达的影响

张博，叶阳，张雨薇，张淑香，黄树明，孙忠人*

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

针 灸 推 拿

电针对卵巢摘除大鼠E2水平及相关受体表达的影响

张博1，叶阳2，张雨薇2，张淑香1，黄树明1，孙忠人2*

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：观察电针对卵巢摘除大鼠E2水平及海马ERα和TrkA表达的影响。方法：SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，除假手术组外，其余2组均进行卵巢切除术制备模型，15天后，电针组大鼠给予电针刺激，隔日1次，持续45天。观察各组大鼠进行一般状态，采用ELISA法检测血清E2水平，并通过免疫组化法测定大鼠海马CA1区ERα和TrkA含量。结果：与假手术组比较，模型组大鼠一般状态较差，血清E2水平明显降低，海马CA1区ERα和TrkA表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，电针组大鼠一般状态得到改善，血清E2水平升高(P<0.05)，海马CA1区ERα和TrkA表达明显升高(P<0.01,P<0.05)。结论：电针可提高卵巢摘除大鼠的E2水平，影响海马CA1区ERα和TrkA表达，这可能是电针改善卵巢摘除大鼠记忆障碍的机制之一。

电针；卵巢摘除；雌二醇；雌激素受体α

绝经后女性认知功能下降的同时伴随雌激素水平明显降低[1]，激素替代疗法可在绝经早期改善雌激素水平和认知功能[2]，但这一疗法颇具争议[3]。针刺可改善低雌激素水平动物模型的认知功能[4]，但相关机制有待明确。雌激素和脑内神经生长因子分别通过与雌激素受体α(estrogen receptor，ERα)和酪氨酸激酶受体A(tropomyosin receptor kinase A，TrkA)结合而实现神经元保护作用。本实验对各组大鼠进行一般状态的观察，并采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定大鼠血清雌二醇(17β- estradiol，E2)水平，通过免疫组化法检测大鼠海马区ERα和TrkA表达情况，以期为后续的临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和模型制备

3月龄雌性SD大鼠，体质量190～220 g，36只。随机分为3组，假手术组，模型组和电针组。给予各组大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)，模型组和电针组大鼠进行双侧卵巢切除术，假手术组仅切开皮肤，术后予以青霉素8万U肌注3天。

1.2 选穴、治疗和取材

电针组大鼠卵巢切除15天后进行电针治疗，根据《实验针灸学》选取“百会”“肾俞”“后三里”穴[5]，在不麻醉状态下，选用半寸针灸针针刺相应穴位。采用疏密波，频率5 Hz，强度为4～5 mA，强度以引起大鼠后肢抖动为宜，在上午9～10点进行，每次30 min，隔日1次，两侧穴位交替进行电针刺激，百会穴每次均给予刺激，隔日1次，治疗45天。治疗结束后，将大鼠麻醉，眼底取血，分离血清，随后进行灌流固定，取脑，浸于4%多聚甲醛中固定24 h后，石蜡包埋，用于免疫组化检测。

1.3 试剂与仪器

ERα一抗(博奥森，bs-0725R)；TrkA一抗(博士德，BA0404)；SABC免疫组化试剂盒(博士德，SA1022)；Cloud- Clone ELISA试剂盒；MUTISKAN MK3型酶标仪(Thermo)；ECLIPSE 50i显微镜(Nikon)；KD-TS3D1型生物组织自动脱水机(浙江科迪)；TB-718型生物组织自动包埋机(湖北泰维)；R138型轮转式切片机(湖北泰维)；TK-212型自动恒温漂片仪(湖北泰维)；TK-213型自动恒温烘片仪(湖北泰维)。

1.4 大鼠一般状态的观察

观察卵巢摘除及电针治疗后大鼠的毛色，活动情况及对外界刺激的反应等情况。

1.5 ELISA法检测各组大鼠血清E2水平

分别设标准孔、待测样品孔和空白孔。空白孔加蒸馏水或标准品稀释液，其余相应各孔中加待测样品或不同浓度标准品50 μl，随后每孔立即加入检测溶液A工作液50 μl，37℃温育1 h。洗涤，各孔加检测溶液B工作液100 μl，37℃温育30 min。每孔加入底物溶液90 μl，37℃避光显色20 min。每孔加入终止液50 μl，混匀后即刻用酶标仪在450 nm波长测量各孔OD值。

1.6 免疫组化检测

将固定后的脑组织矢状切开后，经组织自动脱水机按梯度脱水透明，石蜡包埋成蜡块。以4 μm厚切片，每隔5张取1张，进行免疫组化实验。

免疫组化SABC法：脱蜡、水化； 3% H2O2室温封闭15 min，以灭活内源性酶；热修复20 min； 5%BSA室温封闭20 min，甩去多余液体，不洗。滴加适当稀释的兔抗ERα抗原的抗体(1∶100)，37℃孵育90 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min；滴加试剂SABC，37℃孵育20 min；以上各步骤间，PBS洗3次，各5 min； DAB显色10 min，反应充分即用PBS终止反应；脱水、透明、封片、镜检。阴性对照用PBS替代一抗孵育。

将各组切片进行镜下拍摄(200×),将棕黄色颗粒作为阳性参考，应用Image Pro Plus 6.0测量累积光密度(IOD)和阳性细胞面积(Area),依据公式:平均光密度=IOD/Area，计算ERα及TrkA的平均光密度。

1.7 统计分析方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态

随着卵巢摘除天数的增多，大鼠体毛疏松不光亮，对外界的刺激反应迟缓，倦缩少动抱团。电针治疗后，大鼠体毛光泽柔顺，反应较敏捷，活动频繁。与模型组比较，电针组大鼠的一般状态有良好的改善。

2.2 电针对卵巢摘除大鼠血清E2水平的影响

研究结果显示，卵巢摘除60天后，与假手术组相比，模型组大鼠的血清E2水平明显降低(P<0.01)。与模型组相比，经45天电针治疗的大鼠血清E2水平升高(P<0.05)，见表1，提示电针提高了卵巢摘除大鼠的血清E2水平。

表1 电针对卵巢摘除大鼠血清E2水平的影响

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 电针对卵巢摘除大鼠海马CA1区ERα含量的影响

ERα的阳性表达主要位于细胞膜上，见图1。研究显示，与假手术组相比，模型组海马CA1区ERα表达明显减少(P<0.01)。与模型组相比，电针组海马CA1区ERα表达明显增多(P<0.01)，见表2。结果提示卵巢摘除减少了ERα表达，而电针治疗可逆转由卵巢摘除引起的ERα表达减少。

表2 电针对卵巢摘除大鼠海马CA1区ERα含量的影响

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。

2.4 电针对卵巢摘除大鼠海马CA1区TrkA含量的影响

TrkA的阳性表达位于细胞膜及细胞浆，见图2。实验结果显示，与假手术组相比，卵巢摘除大鼠海马内TrkA含量明显减少(P<0.01)。与模型组相比，电针组大鼠海马内TrkA含量增加(P<0.05)，见表3。结果提示卵巢摘除减少了大鼠海马区TrkA表达，而电针治疗可逆转由卵巢摘除引发的TrkA表达减少。

图1 各组大鼠海马CA1区ERα表达 注：箭头所示为ERα阳性表达。

图2 各组大鼠海马CA1区TrkA表达 注：箭头所示为TrkA阳性表达。

组别n平均光密度假手术组80.07±0.01模型组80.05±0.01**电针组80.06±0.01#

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

本实验所选用的卵巢切除术复制了女性绝经期的低雌激素水平，中医学认为年老者多肾虚，因此本实验以补肾为原则选取针刺穴位，分别为肾俞、后三里和百会穴。肾为先天之本，先天之精所藏之处，针刺肾俞可起到补益肾气的作用。脾胃为后天之本，气血生化之源，充盛人体先天之精，针刺后三里可健脾胃、 益气血。百会乃诸阳之会，位于督脉上，针刺此穴可起到调理阴阳的作用。此三穴共同针刺，可起补肾益精、调理一身阴阳之效，这与西医的提高性激素水平相近。本实验结果证实，电针治疗提高了卵巢摘除大鼠血清E2水平，并实现了大鼠毛色，反应速度及活动频率等一般状态的改善。有报道指出，针刺可增加模型动物雌激素水平[6],这与本实验结果相一致。

雌激素具有调节脑内神经递质，减轻神经毒性物质的损害及通过促进突触生长等实现神经元保护作用[3]，在中枢神经系统的作用机制大致分为基因途径和非基因途径[7]。基因途径即雌激素与位于细胞质和细胞核上的雌激素受体ERα和雌激素受体β(Estrogen receptor，ERβ)结合形成二聚体进入细胞核，与位于靶基因启动区的雌激素反应因子结合或与其他转录因子和相应的反应因子相结合从而调控基因表达，此途径的信号转导起效迅速。神经生长因子与其受体TrkA结合后，才能起到增强神经元存活、分化及突触可塑性的作用。本实验结果显示，卵巢摘除降低了大鼠海马CA1区ERα和TrkA的表达，而电针百会、肾俞、后三里穴可逆转二者表达减少，这可能与课题组前期研究发现的电针改善大鼠学习记忆能力有关[8-9]。电针不仅增加了E2水平，而且增加了相关受体的敏感性，进而实现了大鼠一般状态和记忆功能的改善。研究证实，针刺肾俞，后三里可改善去势大鼠的学习记忆能力[10]，针刺百会穴可增强正常大鼠的记忆能力[11]。这与本课题组前期实验结果相一致。

然而，雌激素与ER复合物进入细胞核后，通过一系列反应才能实现生物学效应，如与雌激素受体反应原件(estrogen response elements，ERE)和CREB反应原件(CREB response elements，CRE)结合才能激活下游信号[12]，而以补肾为治疗原则的针刺疗法是否能激活这些因子的表达，还有待进一步实验的深入研究。

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[2] 秦家云,彭丹红,王艳,等.激素补充治疗对绝经早期妇女血清生殖激素水平与认知功能的影响[J].现代预防医学,2012,39(18):4675-4677.

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Effect of Electroacupuncture on E2Concentration and Expression of Related Receptors in Ovariectomized Rats

ZHANG Bo1, YE Yang2, ZHANG Yu-wei2, ZHANG Shu-xiang1, HUANG Shu-ming1, SUN Zhong-ren2*

(1.Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective: To observe the effect of electroacupuncture on E2concentration and expression of ERα and TrkA in ovariectomized rats. Methods: SD rats were randomly divided into three groups, Sham group, Model group and Electroacupuncture (EA) group.Rats in Model group and EA group were ovariectomized except those in Sham group. 15 days after operation,rats in EA group were treated by electroacupuncture, once every other day for 45 days. The general status of rats was observed,and the concentration of serum E2was measured by ELISA and expression of ERα and TrkA in hippocampal CA1 area was determined by immunohistochemical staining. Results: The general status of rats in Model group was worse than that in Sham group. Compared with Sham group, the Model group showed a declined concentration of serum E2and a decreased level of ERα and TrkA. However, the general status of rats was improved in EA group. Compared with Model group, EA group showed an increased concentration of serum E2and an increased expression of ERα and TrkA. Conclusion: Electroacupuncture can increase the concentration of serum E2and the expression of ERα and TrkA, and this may be one of the mechanisms for electroacupuncture to improve the memory dysfunction induced by ovariectomy in rats.

Electroacupuncture;Ovariectomy;Estradiol;Estrogen receptor α

国家自然科学基金青年科学基金项目(No.81603321)；黑龙江省博士后资助项目(No.LBH-Z13200)；黑龙江省自然科学基金项目(No.H2016072)；黑龙江中医药大学科研基金项目(No.2015bs04)

张博(1984-)，女，中医学博士后，助理研究员，主要研究方向：中医药防治老年性痴呆。

孙忠人*(1960-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向：针刺防治脑与脊髓神经疾病。

2016-12-10

R246

A

1002-2406(2017)03-0074-04

修回日期：2016-12-27