洋金花果皮中生物碱成分及抗肿瘤活性研究

杨炳友，周永强，刘艳，匡海学

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

洋金花果皮中生物碱成分及抗肿瘤活性研究

杨炳友，周永强，刘艳，匡海学*

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究洋金花果皮中生物碱成分及抗肿瘤活性。方法：采用硅胶、Sephadex-LH20及HPLC等色谱方法对化合物进行分离和纯化，并利用1H-NMR、13C-NMR及MS波谱方法鉴定化合物的结构，以肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901肿瘤细胞为受试细胞，采用MTT法评价化合物的抗肿瘤活性。结果：该研究从洋金花果皮70%乙醇回流提取物的乙酸乙酯部位中共分离得到10个生物碱类化合物，分别鉴定为cyclo(PheTyr)(1)、9-hydroxycanthin-6-one(2)、(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid(3)、1-ribityl-2,3-diketo-1, 2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethyl-quinoxaline(4)、grossamide(5)、cannabisin F(6)、hyoscyamine(7)、trans-N-p-coumaroyl tyramine(8)、N-trans-feruloyloctopamine(9)和(2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide(10)；体外抗肿瘤实验表明,1～10号化合物均具有潜在肿瘤细胞抑制活性。结论：化合物1～4首次从茄科植物中分离得到，且化合物1、2、5、6和8表现为较强的抗肿瘤活性。

茄科；果皮；生物碱；洋金花；抗肿瘤活性

洋金花为茄科植物白曼陀罗(DaturametelL.)，其蒴果圆球形，表面有疏短刺，成熟后淡褐色[1]。洋金花的药用历史悠久，2015版《中国药典》记载其性味辛、温，有小毒；具平喘止咳、镇痛解痉、麻醉之功效[2-5]。目前从洋金花中分离的生物碱主要为东莨菪碱、莨菪碱、曼陀罗碱及阿朴东莨菪碱等莨菪烷类生物碱[6]。这些化学成分通常具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等活性。然而，关于洋金花果皮中生物碱成分的文献鲜有报道。因此，为了深入探讨洋金花果皮中的化学成分、寻找其多种生物活性的药效物质基础，本文对洋金花果皮的乙酸乙酯萃取部位化学成分深入研究，共分离鉴定了10个生物碱。

1 仪器与材料

2695-2996型分析HPLC(美国Waters公司)；Shimadzu，LC-6AD型制备HPLC(日本岛津)；SunFireC18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司)；SunFireC18色谱柱(250 mm×10 mm，5 μm，美国Waters公司)；Bruker-400超导核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；Acquity Ultra Performance LCTM液质联用色谱仪(美国Waters公司)；ELx800酶标仪(美国BioTek公司)；150i型二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；色谱用硅胶(青岛海洋化工厂)；Sephadex-LH20(GE Healthcare公司)；提取分离用试剂均为分析纯；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM(Sigma公司)；10 000 U/mL青霉素/链霉素(美国Corning公司)；噻唑蓝(MTT Biotopped公司)；DMSO(Sigma公司)；紫杉醇(Sigma公司)；96孔板(美国Corning公司)。

实验所用的肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901细胞株均购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

洋金花果实采收于黑龙江中医药大学药用植物园，经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋鉴定为茄科曼陀罗属植物白曼陀罗(DaturametelL.)的果实。原植物标本(20140905)保存于黑龙江中医药大学中药化学教研室。

2 提取与分离

干燥的洋金花果皮(35 kg)，用70%乙醇提取3次，每次3 h，减压回收溶剂，得提取物5.6 kg。提取物加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(110 g)经正相硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇系统(300:1-0:1)梯度洗脱，得到A～H 8个部分。E通过硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇系统，60:1-0:1)，得到10个流分。流分5直接析出白色沉淀即得化合物4(37 mg)。流分2、3、4、7经HPLC分离即得化合物1(28 mg)、2(14 mg)、3(13 mg)、5(17 mg)、6(10 mg)、7(13 mg)、8(12 mg)和9(12 mg)。C通过硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇系统，30:1-0:1)，得6个流分。流分3经HPLC分离即得化合物10(22 mg)。

3 结构鉴定

3.1 化合物1

无色针状结晶(甲醇)。ESI-MS m/z：311.131 7 [M+H]+，分子式为C18H18N2O3。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：3.94(1H, t, J=5.4 Hz, H-2)，3.91(1H, t, J=5.4 Hz, H-12)，2.18(2H, m, H-3)，2.57(2 H, m, H-13)，6.83(2H, d, J=8.4 Hz, H-15, 19)，6.67(2H, d, J=8.4 Hz, H-16, 18)，7.03(2H, d, J=7.0 Hz, H-5, 9)，7.24(2H, m, H-6, 7, 8)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：55.4(C-2)，38.5(C-3, 13)，136.6(C-4)，129.7(C-5, 9)，128.2(C-6, 8)，126.4(C-7)，166.2(C-10)，55.7(C-12)，126.4(C-14)，130.8(C-15, 19)，115.0(C-16, 18)，156.1(C-17)，166.1(C-20)。以上数据与文献报道[7]数据对比，鉴定化合物1为cyclo(PheTyr)。

3.2 化合物2

无定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：257.084 8 [M+H]+，分子式为C14H12N2O3。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：8.15(1H, d, J=5.2 Hz, H-3)，7.75(1H, d, J=5.2 Hz, H-4)，7.94(1H, d, J=8.5 Hz, H-5)，6.69(1H, dd, J=8.5 Hz, J=2.1 Hz, H-6)，6.89(1H, d, J=1.9 Hz, H-8)，2.83(1H, t, J=7.3 Hz, H-1′)，3.26(1H, t, J=7.3 Hz, H-2′)，11.3(1H, br.s, NH)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：142.8(C-1)，137.3(C-3)，111.8(C-4)，122.5(C-5)，109.7(C-6)，158.2(C-7)，96.6(C-8)，142.3(C-9)，113.8(C-10)，127.7(C-11)，133.9(C-12)，31.4(C-1′)，27.8(C-2′)，174.1(C-3′)。以上数据与文献报道[8]数据对比，鉴定化合物2为9-hydroxycanthin-6-one。

3.3 化合物3

白色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：160.028 0 [M+H]+，分子式为C4H5N3O4。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：10.5 (1H, s, 7-COOH)，5.2(1H, dd, J=1.2 Hz, J=8.2 Hz, H-4)，5.8(1H, s, 3-NH)，6.9(1H, d, J=8.2 Hz, 6-NH)，8.0(1H, s, 1-NH)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：173.5(C-7)，157.4(C-5)，156.7(C-2)，62.4(C-4)。以上数据与文献报道[9]数据对比，鉴定化合物3为(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid。

3.4 化合物4

无色结晶(甲醇)。ESI-MS m/z：325.329 1 [M+H]+，分子式为C15H20N2O6。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：11.86(1H, s, 4-NH)，6.92(1H, s, H-5)，7.33(1H, s, H-8)，2.19(3H, s, H-11)，2.22(3H, s, H-12)，4.52(1H, d, J=3.8 Hz, H-1′a)，3.99(1H, d, J=2.1 Hz, H-1′b)，4.05(1H, m, H-2′,)，3.58(1H, m, H-3′)，3.61(1H, m, H-4′)，3.44(1H, m, H-5′a)，3.58(1H, m, H-5′b)；13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：155.7(C-2)，153.8(C-3)，116.0(C-5)，131.2(C-6)，130.9(C-7)，116.5(C-8)，124.9(C-9)，123.3(C-10)，19.3(C-11)，18.7(C-12)，44.5(C-1′)，68.1(C-2′)，73.6(C-3′)，72.7(C-4′)，63.4(C-5′)。以上数据与文献报道[10]数据对比，鉴定化合物4为1-ribityl-2,3-diketo-1,2,3,4-tetrahydro-6,7- dimethyl-quinoxalin。

3.5 化合物5

棕色膏状物(甲醇)。ESI-MS m/z：625.247 2 [M+H]+，分子式为C36H36N2O8。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：169.4(C-10″)，165.2(C-10′)，155.6(C-4′)，155.6(C-4″)，148.7(C-4)，147.6(C-3‴)，146.8(C-4‴)，144.0(C-3)，138.7(C-7)，130.5(C-1‴)，129.5(C-2′, 6′)，129.4(C-2″, 6″)，129.2(C-1′, 1″)，128.5(C-1)，128.5(C-5)，119.6(C-8)，118.8(C-6‴)，115.9(C-6)，115.4(C-5‴)，115.1(C-3′, 5′)，115.1(C-3″, 5″)，111.7(C-2)，110.3(C-2‴)，87.6(C-7‴)，55.8(C-8‴)，55.7(3-OCH3)，55.6(3‴-OCH3)，40.8(C-8′)，40.7(C-8″)，34.3(C-7′)，34.1(C-7″)。以上数据与文献报道[11]数据对比，鉴定化合物5为grossamide。

3.6 化合物6

白色无定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：625.247 2 [M+H]+，分子式为C36H36N2O8。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：125.5(C-1)，112.5(C-2)，148.9(C-3)，147.5(C-4)，115.2(C-5)，122.3(C-6)，126.3(C-7)，141.6(C-8)，168.8(C-9)，56.1(3-OCH3)，130.8(C-1′)，130.7(C-2′)，116.3(C-3′)，157.0(C-4′)，116.3(C-5′)，130.7(C-6′)，35.6(C-7′)，42.2(C-8′)，131.9(C-1″)，113.8(C-2″)，150.5(C-3″)，149.5(C-4″)，116.3(C-5″)，125.3(C-6″)，141.1(C-7″)，121.0(C-8″)，165.5(C-9″)，56.5(3‴-OCH3)，131.3(C-1‴)，130.7(C-2‴)，116.3(C-3‴)，156.9(C-4‴)，116.3(C-5‴)，130.7(C-6‴)，35.8(C-7‴)，42.6(C-8‴)。以上数据与文献报道[12]数据对比，鉴定化合物6为cannabisin F。

3.7 化合物7

无定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：290.167 8 [M+H]+，分子式为C17H23NO3。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：59.9(C-1)，34.1(C-2)，65.6(C-3)，34.2(C-4)，60.0(C-5)，23.9(C-6)，24.2(C-7)，38.3(C-8)，171.2(C-9)，54.3(C-10)，63(C-11)，136.2(C-12)，128.6(C-13)，128(C-14)，127.3(C-15)，128(C-16)，128.6(C-17)。以上数据与文献报道[13]数据对比，鉴定化合物7为hyoscyamine。

3.8 化合物8

无定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：284.120 8 [M+H]+，分子式为C17H17NO3。13C-NMR(100 MHz, CD3OD)δ：127.7(C-1)，130.6(C-2)，116.3(C-3)，160.5(C-4)，116.3(C-5)，130.6(C-6)，141.8(C-7)，118.4(C-8)，169.3(C-9)，131.3(C-1′)，130.7(C-2′)，116.7(C-3′)，157.0(C-4′)，116.7(C-5′)，130.7(C-6′)，35.8(C-7′)，42.6(C-8′)。以上数据与文献报道[14]数据对比，鉴定化合物8为Trans-N-p-coumaroyltyramine。

3.9 化合物9

白色晶体(甲醇)。 ESI-MS m/z：330.126 3[M+H]+，分子式为C18H19NO5。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：128.3(C-1)，111.6(C-2)，149.9(C-3)，149.3(C-4)，116.5(C-5)，123.4(C-6)，142.4(C-7)，118.7(C-8)，169.6(C-9)，134.7(C-1′)，128.5(C-2′)，116.2(C-3′)，158.1(C-4′)，116.2(C-5′)，128.5(C-6′)，73.5(C-7′)，56.4(3-OCH3)，48.3(C-8′)。以上数据与文献报道[15]数据对比，鉴定化合物9为N-trans-feruloyloctopamine。

3.10 化合物10

不定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：330.126 3 [M+H]+，分子式为C18H19NO5。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：128.3(C-1)，111.6(C-2)，149.9(C-3)，149.3(C-4)，116.1(C-5)，123.3(C-6)，142.2(C-7)，118.7(C-8)，169.5(C-9)，134.7(C-1′)，128.4(C-2′)，116.5(C-3′)，158.1(C-4′)，116.5(C-5′)，128.4(C-6′)，73.4(C-7′)，48.3(C-8′)，56.4(3-OCH3)。将数据与文献报道[16]数据对比，鉴定化合物10为(2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide。

4 抗肿瘤细胞活性测试

参照文献方法[17]检测化合物1～10在5、10、20、40和80 μg/mL浓度下对肿瘤细胞株肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901的抑制活性。紫杉醇作为阳性对照。结果见表1。

表1 化合物1～10的抗肿瘤活性

实验结果表明，化合物1～10均表现出一定的抗肿瘤活性。其中，化合物1、2、5、6和8表现为较强的抗肿瘤活性。

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Alkaloids with Antitumor Activities from Pericarps ofDaturametelL.

YANG Bing-you,ZHOU Yong-qiang,LIU Yan,KUANG Hai-xue*

(Key Laboratory of Chinese Materia Medica of Ministry of Education, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective：To study the alkaloids from pericarps ofDaturametelL. and screen the antitumor activities of the isolated compounds. Methods：The separation and purification were taken by silica gel column chromatography, Sephadex-LH20 and semi-preparative HPLC, and the structural identification was based on physicochemical property,1H-NMR and13C-NMR as well as HR-MS data. The isolated compounds were evaluated according to antitumor activities of HepG-2, A549 and SGC-7901 by MTT method. Results：Ten alkaloids were obtained from the ethyl acetate of 70% ethanol extract of pericarps of D. metel L. and the structures were identified as cyclo(PheTyr)(1), 9-hydroxycanthin-6-one(2), (2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid(3), 1-ribityl-2,3-diketo-1,2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethyl-quinoxaline(4), grossamide(5), cannabisin F(6), hyoscyamine(7), Trans-N-p-coumaroyl tyramine(8), N-trans-feruloyloctopamine(9) and (2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide(10), respectively. All isolated possessed the potential anti-tumor activity in vitro. Conclusion：Compounds 1-4 are isolated from the plants of Solanaceae for the first time, and compounds 1, 2, 5, 6 and 8 exhibit a strongly antitumor activity.

Solanaceae; Pericarps; Alkaloids;DaturametelL.; Antitumor activity

黑龙江省高校长江学者后备支持计划(No.2013CJHB006)；黑龙江中医药大学研究生创新项目(No.yjscx2016010)

杨炳友(1970-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药及复方药效物质基础研究。

匡海学*(1955-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向：中药及复方药效物质基础研究。

2017-01-21

R28

A

1002-2406(2017)03-0005-04

修回日期：2017-02-07