骨形态蛋白促进骨修复的临床价值研究

陈改改，李琳琳，李美华*

(1.吉林大学第二医院 口腔科，吉林 长春130041;2.吉林大学中日联谊医院)

骨形态蛋白促进骨修复的临床价值研究

陈改改1，李琳琳2，李美华1*

(1.吉林大学第二医院 口腔科，吉林 长春130041;2.吉林大学中日联谊医院)

目的 观察骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic proteins,BMP)对种植体周围骨愈合的早期影响，观察BMP促进种植体周围骨整合的作用。方法 采用兔子 24只，按种植体周围局部注射药物的不同随机分成 2组，每组12只，0.9%NaCl 对照组、BMP-2组。分别在 3、7、10 天处死动物，取出植入体及其周围组织，制作切片，常规 HE 染色，对组织学表现进行观察。结果 HE染色显示：0.9%NaCl 对照组：3天时有多个多核异物巨细胞甚至形成异物肉芽肿、均质粉染的组织坏死，肌组织中间大量的炎细胞浸润。7天和10天炎症反应明显减轻，但仍存在,未见钙盐沉积，有少量胶原纤维形成。BMP-2实验组：3天时钙盐沉积较轻、炎症反应较重、大量炎细胞和纤维母细胞浸润,肌组织之间炎症反应也较重，7天、10天时钙盐沉积依然存在，炎症反应存在但减轻，肌组织间隙炎细胞浸润减少。结论 种植术后种植体周围加入BMP-2可减小种植体周围的早期炎症反应，可以加速种植体周围骨的形成过程，提高种植体周围骨结合率，缩短种植体周围骨愈合时间。

种植体;骨修复;BMP;炎症反应;HE染色

(ChinJLabDiagn,2017,21:0882)

种植体与周围骨组织形成稳定的骨结合是种植修复成功的前提。临床上种植术后早期炎症反应影响种植体的初期及后期稳定性。如何减少种植体植入后的早期炎症反应，缩短种植体周围骨整合时间，是目前研究的热点。近年来研究发现，骨再生的过程中有多种骨生长因子的表达。BMP是一种疏水性酸性多肽 ,与羟基磷灰石有较高的亲和力 ,是在诸多因子中唯一能够单独诱导骨组织异位成骨的生长因子。这种活性蛋白可以使未分化的间充质细胞化学趋化、聚集、定向分化为成骨细胞 ,合成胶原促进骨基质形成 ,形成钙化的骨组织。为探讨BMP-2对种植体周围骨结合的早期影响，本研究建立了兔髂骨种植体模型，将BMP-2作用于种植体周围，以期观察种植体周围早期的骨结合，为临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用兔子 24只，均重2-2.5 kg，雌雄不限。由吉林大学白求恩医学院动物实验中心统一管理，均以纯净水、全营养颗粒饲料喂养。

1.2 实验器械

兔台、剪刀、弯盘、镊子、无菌手术手套、无菌手术洞巾、刀片、刀柄、眼科剪、止血钳、持针器、刮匙、骨膜剥离器、可吸收缝线、绷带、纱布、一次性注射器、一次性静脉注射针、标本瓶。

种植机日本 NSK Surgic XT Plus，负压吸引器上海五相仪器仪表有限公司 YX932D，显微镜 OLYMPUS BX52，数码相机OLYMPUS SP810，显微照相系统(吉林大学白求恩医学实验设备处提供)。医用螺纹状种植体24枚。

1.3 实验试剂

注射用鼠BMP-2 美国派普泰克公司(Peprotech Company，USA)，水合氯醛中国医药上海化学试剂公司，4% 中性福尔马林、二甲苯吉林大学白求恩基础医学院病理实验室，苏木精、伊红染液北京诺博莱生物科技有限公司。

1.4 实验方法

BMP-2剂量的选择：依据文献中实验结果[1,2]，我们选用BMP-2剂量为1.0 mg，术前用2 ml生理盐水充分溶解。

将24只兔子随机分成两组：1.0 mg BMP-2实验组及0.9%NaCl对照组。以水合氯醛麻醉家兔，备皮、消毒铺巾。无菌条件下，皮肤切开，逐层分离，充分暴露左右髂骨。以牙科种植机在兔髂骨内制造缺损，在缺损内植入纯钛种植体，制作种植体植入髂骨模型。每天上午10点钟，在兔子髂骨种植体边缘骨膜下注射1.0 mg BMP-2注射液，注射1次/天，连续3 d;对照组，在相同的时间在兔子髂骨注射剂量相同的生理盐水。种植术后3、7、10天各处死4只实验动物和对照组兔子，获取兔髂骨种植体周围软硬组织标本。

1.5 观察指标

1.5.1 大体观察 种植体周围软硬组织愈合情况；种植体有无松动脱落。数码相机拍照。

1.5.2 组织学观察 种植体周围软硬组织切片，HE染色：a.脱蜡:二甲苯脱蜡2-3次，每次5- 10 min.b.水化:100%乙醇中浸泡两次，每次5 min,95%,90%,80%,70%乙醇各浸泡2 min，置蒸馏水中浸泡2 min.c.染色:苏木精中浸泡15-20 min，流水冲洗1 min,1%盐酸乙醇分化(提插数下)5 s,流水冲洗15 min返蓝，蒸馏水1-2 min，放入伊红中浸泡10-12 min.d.脱水:梯度乙醇脱水(70%,80%,90%各1 min,95%,100%各5 min ).e.透明:二甲苯透明两次共10 min.f.封片:擦去切片周围多余二甲苯，勿干涸，滴中性树胶，盖玻片封固。显微镜观察结果。

2 结果

2.1 大体观察

术后所有实验动物均无死亡，进食活动正常，手术切口愈合良好，无红肿化脓或瘘管形成。种植体均无松动、脱落，与骨组织间未见软组织存在。见图1。

图1 所有伤口愈合良好，无红肿、化脓、种植体均无松动脱落

2.2 组织学观察

种植体周围注射BMP-2的组织切片显示：术后3天时钙盐沉积较轻、炎症反应较重，大量炎细胞和纤维母细胞浸润、炎症面积较大。肌组织之间炎症反应较重。术后7天及10天时钙盐沉积增多，炎症反应依然存在，肌组织间隙炎细胞浸润减少，有大量的胶原纤维束形成(图2)。

种植体周围注射NaCl的组织切片显示：3天时有多个多核异物巨细胞甚至形成异物肉芽肿、均质粉染的组织坏死，肌组织中间大量的炎细胞浸润。7天和10天炎症反应明显减轻，异物巨细胞消失，肌组织间炎细胞浸润依然存在，未见钙盐沉积，有少量胶原纤维形成。(图3)

实验组3天 实验组7天 实验组10天

对照组3天 对照组7天 对照组10天

3 讨论

在种植体周围骨愈合的过程中可产生大量相关的内源性骨生长因子，其中骨形态发生蛋白2的作用尤为重要。BMPs属于转化生长因子β超家族成员，其是一种多功能生长因子，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，其相对分子质量为18 000-50 000。目前己分离的BMPs有47种[3]，包括BMP-1,BMP-2,BMP-4,BMP-6和BMP-9等，其中BMP-2在骨形成和骨吸收过程中均有重要作用。

Paul[4]等指出种植体周围骨愈合可分为早期阶段及晚期阶段。其中早期阶段非常重要，涉及身体对外来物质的初始反应：蛋白质吸附，血小板活化，凝血和炎症过程。这个过程可以形成稳定的纤维蛋白凝块，并产生大量的生长因子。愈合的晚期阶段涉及骨的重塑过程，并指出该过程类似于在骨折部位发生的骨愈合的过程。Lin[5]等研究发现，组织学上，种植体植入后的愈合类似于拔牙窝愈合。但早期阶段会出现愈合延迟，炎症细胞浸润增多。3天时，在缺损区域看到一些血块和少量细胞，它们中的大多数是免疫细胞和分散的上皮细胞。到7天，缺陷区域中的细胞密度更高，炎症反应明显。在10天，缺损部位主要由成纤维细胞填充。种植边界变得不太明确，新形成的骨开始生长到缺损部位。14天时，更多的缺损区被新形成的骨替换。有研究显示[6]，骨损伤侧术后3d即可刺激内源性BMP释放，术后1周BMP浓度达高峰，术后2周BMP分泌逐渐减少。术后6周阳性细胞消失，但随着骨重建过程增强，BMP分泌又有增高趋势，说明内源性BMP的分泌随着骨损伤物修复过程呈阶段性，且对骨痴的形成及骨重建过程起着重要作用。在本实验中实验组可以在外源性BMP-2的作用下可以使种植体周围BMP-2生长因子始终保持在较高浓度。本研究中，术后3天实验组及对照组炎症反应均比较大，实验组已开始有少量钙盐沉积；术后7天实验组炎症反应仍然存在但减轻，钙盐沉积及胶原纤维逐渐增多，10天时炎症反应明显变少，可见较多胶原纤维及钙盐沉积。而对照组7天和10天异物巨细胞消失，炎症反应减轻，肌组织间炎细胞浸润依然存在，仍无钙盐沉积，但有少量胶原纤维形成。实验组在3天即开始出现钙盐沉积，7天和10天时钙盐及胶原纤维逐渐增多，而对照组在第10天时才开始出现少量胶原纤维，并无钙盐沉积，说明外源性BMP-2可以促进种植体周围早期骨愈合进程，可以缩短种植体周围骨愈合时间。

[1]王弘毅.RhMNV-BMP-2促进兔桡骨远端骨缺损愈合的有效性和剂量-成骨关系研究[D].上海：上海交通大学医学院，2008：1-52.

[2]Hyundai K M,Se HO,Jong ML,et al．Porous membrane with reverse gradients of PDGF-BB and BMP for tendon-to-bone repair:In vitro evaluation on adipose-ostem cell differentiation[J].Acta Biomaterialial，2014,10:1272.

[3]Chubinskaya S,Kuettner KE .Regulation of osteogenic proteins by chondrocytes[J].Int J Biochem Cell Biol,2003，35 (9):1323.

[4]Paul RT Kuzyk,Emil H Schemitsch.The basic science of peri-implant bone healing[J].Indian Journal of Orthopaedics,2011,45(2):108.

[5]Zhao L,Hector F.Rios,Sarah L.Volk and etal,Gene expression dynamics during bone healing and osseointegration[J].Journal of Periodontology，2011,82(7):1007.

[6]王鹏程，张英泽，刘永谦，等.内源性骨形态发生蛋白在骨修复中的作用[J].中国矫形外科杂志,1999,5(6):348.

Clinical value of bone morphogenetic protein in promoting bone repair

CHENGai-gai,LILin-lin,LIMei-hua*.

(StomatologyDepartmentoftheSecondHospital,JilinUniversity,Changchun130041,China)

Objective To observe the early bone healing around the implant ,then research the effect of BMP (bonemorphogenetic proteins) on promoting the regeneration of bone.Methods Rabbits 24 were divided into 2 groups randomly,according to different drugs locally injected around implants,12 each group，0.9% NaCl control group,BMP-2 group.In 3,7,10 days ,and killing them and taking out the implants and tissues surrounded ,and making slices ,then conventional HE staining,and observing histologic findings lastly.Results HE staining showed that 0.9% NaCl control group:3 days，there were many multi-core foreign body cells and even the foreign granuloma,homogeneous powder dye tissue necrosis,and a large number of inflammatory cells infiltrating among muscular tissues.7 and 10 days,inflammation decreases significantly but still existing .And there is a small amount of collagen fiber formation ,but no calcium salt deposition.BMP-2 group:3 days,there are the lighter calcium salt deposition and showed the heavier inflammation,a large number of inflammatory cells and fibroblasts.The inflammation among the muscular tissues was heavier.And 7 and10 days,calcium salt depositing still existed,but inflammation among muscular tissues reduced.Conclusion BMP-2 could reduce the early inflammatory reaction ,accelerated the formation of bone ,and could shorten the bone healing time，then increased the long-term success rate of implant-prosthesis.

implant;bone regeneration;BMP;inflammatory reaction;HE stained

吉林省科技发展计划项目(No.20150101203JC)；吉林大学白求恩医学科研支持计划-前沿交叉学科创新项目(No.2013106019)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0882-04

R783.3

A

2016-11-24)