结合基序蛋白6在结直肠癌组织中的表达及临床意义

王子昕,盛伟伟,董 明,周建平,孔凡民

(中国医科大学附属第一医院 胃肠外科,辽宁 沈阳110001)

结合基序蛋白6在结直肠癌组织中的表达及临床意义

王子昕,盛伟伟,董 明*,周建平,孔凡民

(中国医科大学附属第一医院 胃肠外科,辽宁 沈阳110001)

目的 探讨RNA结合基序蛋白6(RBM6)在结直肠癌(CRC)中表达水平及临床病理学意义。方法 应用免疫组织化学方法检测92例配对的CRC及癌旁组织石蜡包埋标本RBM6表达水平，观察其与CRC病人临床病理学参数的关系；再以Western印迹和qRT-PCR检测28例配对冷冻保存的新鲜CRC及癌旁组织中RBM的蛋白和mRNA表达水平。结果 免疫组化结果显示：RBM6在92例CRC表达明显高于癌旁组织表达水平(癌组织30.4%,28/92 vs 癌旁10.9%，10/92；P<0.01)。卡方检验显示：RBM6的表达与CRC肿瘤的大小、分化程度、浸润深度及淋巴结转移无明显相关性(P>0.05)，但与患者TNM分期和远处转移呈正相关(P=0.026,P=0.021)。单因素分析发现：RBM6高表达CRC患者预后更差(P=0.024)。qRT-PCR和Western印迹结果显示：RBM6在CRC中蛋白和mRNA表达均高于配对癌旁组织 (P<0.01;P=0.009)。结论 RBM6在CRC中呈高表达,并与患者临床分期、远处转移及不良预后相关，可能参与CRC的恶性进展。

结直肠癌；结合基序蛋白6；预后

(ChinJLabDiagn,2017,21:0765)

结直肠癌(Coloractal Cancer,CRC)作为发病率最高的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围呈上升趋势。2012年估计有136万新增病例，并有超过69万人死于此病，占全部癌症死亡人数的8.5%[1]。在中国，CRC的发病率达376.3/10万人，死亡率达191人/10万人，均位居恶性肿瘤第5位[2]。CRC的发生是多因素、多步骤、涉及多种肿瘤信号通路作用的结果，筛选有助于CRC早期诊断及监测预后的肿瘤标记物至关重要。RNA结合基序蛋白(RNA-Binding Motif protein,RBM)是一类mRNA结合酶，能够通过选择性剪切目的基因mRNA，抑制其靶基因表达而发挥作用[3]。以往文献报道，RBM6在肺癌、恶性血液病、乳腺癌、骨骼肌肉瘤等肿瘤组织和细胞中存在不同程度的表达[4-7]，如在肺癌中RBM6通过选择性剪切NUMB转录子，增强癌细胞克隆增殖能力[4]，但其在CRC中研究鲜有报道。本文采用免疫组织化学(IHC)、蛋白印迹(WB)和实时定量聚合酶链式反应 ( qRT-PCR )，检测CRC中RBM6的表达，探讨其表达的临床病理学意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集 2013年1月至2014年12月，筛选我院具有完整临床资料的原发性CRC切除标本92例，均有癌旁组织作为对照。另有28例CRC及配对的癌旁组织标本在术中切除后立即取样，置液氮中冷冻保存。92例患者中，男49例，女43例，患者平均年龄(61±12)岁 ,其中≤65岁为37例，>65岁为55例。术后病理均证实为腺癌。肿瘤部位：结肠45例；直肠47例。根据2011年国内对国际UICC抗癌协会TNM分期标准解读[8]，92例CRC中：Ⅰ期18例,Ⅱ期31例,Ⅲ期34例,Ⅳ期9例。分化程度:高分化18例，中低分化74例。

1.2 主要试剂

RBM6兔抗人单克隆抗体采购自Abcam 公司,GAPDH抗体购自美国Proteintech公司，羊抗兔及鼠二抗采购自北京中杉金桥公司。SP法免疫组织化学试剂盒及DAB显色液采购自福州迈新公司。细胞裂解液(强)、蛋白酶抑制剂、BCA定量试剂、上样缓冲液及ECL发光试剂盒均采购自碧云天生物公司。RNA分离提取试剂盒 Trizol、逆转录试剂盒(DRR047A)、SYBR Green等均采购自日本Takara公司。

1.3 实验方法

1.3.1 IHC

采用SP三步法：所有CRC组织标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋，4 μm连续切片,以二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化。经3%过氧化氢室温 15 min去除内源性过氧化物酶。用pH 7.4的PBS清洗后，置于pH 6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以121℃高压热修复抗原3 min，待自然冷却后，用PBS清洗3遍。滴加山羊血清，室温封闭20 min。滴加RBM6一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜。次日室温静置30 min后，PBS清洗3遍，用生物素标记的羊抗兔IgG孵育，37℃ 20 min。PBS清洗3遍，用过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，37℃15 min。DAB显色，苏木素复染10 min，盐酸酒精分化10 s后水冲洗、脱水、透明，封片。

1.3.2 WB

提取癌及癌旁组织的蛋白质：每块组织称取50 mg，加入300 μl细胞裂解液(强)和3 μl蛋白酶抑制剂，超声粉碎组织20 s，静置30 min后，4℃下12000G离心15 min,收集上清。应用BCA定量试剂盒将样品浓度均定为5 μg/μl,每条泳道的蛋白上样量50 μg,经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,80V 90 min电转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉TBST封闭2 h,分别加入一抗：RBM6,1∶1 000；GAPDH,1∶2 000。4℃低温孵育过夜。TBST洗膜后，用1∶40 000羊抗兔及1∶10 000 鼠二抗分别室温孵育2 h,TBST清洗,增强化学发光剂(ECL) 以凝胶显像仪 (MF-chemibis 3.2 DNR)显像。

1.3.3 qRT-PCR

采用 RNA分离提取试剂 Trizol提取并纯化组织总RNA；根据Takara逆转录和扩增试剂盒说明书进行逆转录和扩增。反应条件:95℃ 5 min 变性； 95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环,所有反应均设立复孔，并以DEPC水代替模板cDNA作为阴性对照。引物均由上海生工设计并合成。RBM6上游引物5’-TGACAGGAAGTGATGGTGTCT-3’；下游引物5’-CTCCAGCCAGTAGCCTGTTG-3’，扩增产物112bp；GAPDH上游引物 5’-CCACCCATGGCAAATTCCCATGGCA-3’；下游引物5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。

1.4 阳性结果判定

RBM6蛋白以胞核和部分胞浆出现棕黄/黄褐色染色为阳性。参考Sheng等[9]的文献评分方法,随机选择5个视野的阳性细胞百分比和染色强度，采用半定量评分方法：①阳性细胞百分数：每个视野记数 100个细胞，计算5个随机视野的阳性细胞的平均百分数，将平均百分数分为4级：阳性细胞数占0-9 % 为0分；10%-24%为1分；25%-49%为2分；50%-74%为3分；≥75%为4分。②排除非特异性染色后，染色强度分为4级：无着色0分；淡黄色1分；黄色或深黄色2分；褐色或棕色3分，分级标准为上述两项乘积:<6分为阴性表达；≥6分为阳性表达。

蛋白印迹结果是根据ECL荧光成像得到的条带和电泳条带的面积和光密度，运用quantity one软件，计算每个条带的灰度值或吸光度值。

qRT-PCR分析结果得到标本中RBM6和GAPDH 的阈值循环数( CT)值与其相对应的GAPDH的 CT 值相减,得到校正 CT 值。如以正常结肠组织为对照，与癌组织比较公式：2^-ΔΔCT= 2^-[(ΔCT癌组织目的基因-ΔCT癌组织内参基因)-(ΔCT癌旁组织目的基因-ΔCT癌旁组织内参基因)] 。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计分析软件，用相关样本Wilcoxon符号秩检验比较RBM6在CRC与癌旁组织IHC染色结果，用卡方检验比较RBM6蛋白表达及其与患者临床病理学参数的关系。采用配对t检验比较配对的癌与癌旁组织蛋白和mRNA表达水平。Kaplan-Meier单因素分析计算累积生存率，显著性分析采用log—rank检验。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RBM6在CRC和癌旁组织中表达

RBM6蛋白在CRC组织中的胞浆及胞核中表达(图1CD)；在癌旁细胞中呈弱或阴性表达(图1AB)。RBM6在CRC组织中高表达占30.4%(28/92)，在癌旁组织中高表达仅占10.9%(10/92)，两者比较有显著的统计学差异 (t=3.934，P<0.01)。

A：癌旁组织中阴性表达； B：癌旁组织中弱表达；C:CRC中中度表达；D:CRC中强表达

2.2 RBM6蛋白表达与CRC患者临床病理学参数关系

通过卡方检验，RBM6蛋白表达水平与CRC患者性别、年龄、肿瘤部位(结肠和直肠)、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移及浸润深度均无统计学差异(P>0.05)。但与患者预后TNM分期(Ⅰ+Ⅱ vs Ⅲ+Ⅳ，P=0.026)及远处转移(P=0.021)呈明显正相关(表1)。

表1 临床病理学资料与RBM6表达的关系

*本研究纳入的远处转移病例，7例以肿瘤引起的急性肠梗阻为首发症状入院，急诊行肿瘤姑息切除；2例存在肝转移，行癌根治术及肝脏部分切除术。

2.3 RBM6蛋白表达与CRC患者术后生存关系

单因素分析发现，RBM6高表达CRC患者较其低表达者预后不良(χ2=5.097,P=0.024)(图2)本研究纳入的9例远处转移病例，其中7例为肿瘤引起的急性肠梗阻为首发症状入院，急诊行肿瘤姑息切除，此部分病例预后较差。

图2 RBM6蛋白表达与CRC患者预后的关系

2.4 RBM6在新鲜CRC及癌旁组织中蛋白和mRNA表达水平

WB显示癌旁组织中 RBM6/GAPDH灰度比为0.447±0.292,CRC组织为0.905±0.834,两者之间有明显统计学差异(t=-3.059,P<0.01) (图3) 。

图3 CRC及癌旁组织中RBM6蛋白表达(取其中七对，N:癌旁组织；C：CRC)

qRT-PCR同样显示RBM6在28例CRC组织中mRNA表达高于配对的癌旁组织(t=-2.836,P=0.009)(图4)。

3 讨论

RBM6是1999年由Timmer等发现于肺癌细胞株，全长137 kb,由21个外显子组成，位于3q21.3，其表达与肿瘤发生密切相关[10]。

研究表明，在急性巨核细胞白血病[5]、乳腺癌[6]和骨骼肌肉瘤[7]等人类肿瘤中存在RBM6 mRNA的高表达。在乳腺癌和骨骼肌肉瘤中，RBM6能够与RBM5形成融合基因，其特异性存在于部分癌组织中并与肿瘤大小呈正相关[7]；在急性巨核细胞白血病中，RBM6能与CSF1R形成融合基因，转染这个融合基因能诱导小鼠发生髓系增生性疾病[5]。而本研究发现：RBM6与CRC患者TNM分期、远处转移及不良预后呈明显正相关，提示其参与CRC恶性进展，对于CRC诊断及预后评估具有重要意义。

图4 A:14组配对CRC与癌旁组织qRT-PCR溶解曲线。B:癌旁组织及CRC中RBM6 mRNA表达水平(取其中14对，N:癌旁组织；C：CRC)

RBM6能调控NUMB的mRNA剪接,敲减RBM6能促进外显子9的跳跃，从而抑制剪接异构体NUMB-PPRL 的形成[4]， NUMB-PPRL降低致NOTCH通路失活，最终抑制肺癌细胞增殖[11]。有文献报道Numb在CRC中呈低表达，并与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴转移呈负相关[12]，在本研究中，RBM6在CRC中呈明显高表达，并与CRC患者临床分期，肿瘤远处转移及不良预后密切相关，肿瘤分期越差，存在远处转移的肿瘤RBM6表达水平越高。同时我们前期研究发现Numb在CRC中表达与RBM6存在负相关趋势(结果尚在统计中)，结合以往研究报道，Numb能够抑制包括胰腺癌、食管癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞侵袭和迁移[13，14]。由此我们推测，RBM6可能通过调节NUMB-PPRL亚型表达，增强CRC细胞的增殖、侵袭及转移力，最终影响CRC恶性进展。

综上所述，RBM6在CRC中呈高表达,并与患者临床分期、远处转移及不良预后相关，可能参与CRC恶性进展。RBM6是否通过调控Numb亚型表达影响CRC生物学行为是我们未来研究方向。

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Expression of RNA binding motif protein 6 in colorectal cancer and its clinical significance

WANGZi-xin,SHENGWei-wei,DONGMing,etal.

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,FirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of RNA binding motif protein 6(RBM6) in colorectal cancer tissue.Methods The expression of RBM6 protein in 92 paired paraffin embedded CRC specimens and adjacent non-cancerous colorectal tissues were detected by Immunohistochemistry.Western blot and quantificational RT-PCR (qRT-PCR) were used to examine the expression of RBM6 mRNA and protein levels in 28 paired fresh CRC specimens and adjuvant non-cancerous tissues.The relationship between the protein expression and clinicopathological features was analyzed.Results RBM6 protein was overexpressed in CRC than that in paired adjacent normal colorectal tissues(P<0.01)．High RBM6 expression was positively correlated with TNM stage and distant metastasis,respectively(P=0.026,P=0.021)，but had no association with tumor size,differentiation,invasion depth and lymph metastasis(P>0.05)．CRC patients with RBM6 overexpression had a worse prognosis(P=0.024).Both protein and mRNA levels of RBM6 were higher in CRC than that in non-tumorous colorectal tissues detected by Western blot and qRT-PCR,respectively (P<0.01;P=0.009).Conclusion RBM6 is overexpressed in CRC and is positively associated with TNM stage,distant metastasis and poor prognosis of CRC patients.Aberrant expression of RBM6 might participate in the aggressive progression of CRC.

colorectal cancer;RBM6;prognosis

辽宁省教育厅特聘教授专项基金(辽财指数 2012-512)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0765-05

R735.3

A

2017-01-14)