长链非编码RNA SNHG7在胃癌中的表达及功能

费正华

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州325000）

·实验研究·

长链非编码RNA SNHG7在胃癌中的表达及功能

费正华

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州325000）

目的 了解长链非编码RNA SNHG7在胃癌组织中的表达情况，以及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测SNHG7在82例胃癌、癌旁组织及胃癌细胞系中的表达情况，分析胃癌组织中SNHG7表达量与临床病理参数的相关性；用siRNA干扰人胃癌BGC823细胞SNHG7表达后，分别用CCK-8法、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。 结果 SNHG7在胃癌组织较癌旁组织中表达明显升高（P＜0.01）；胃癌组织中SNHG7的表达水平与肿瘤的浸润深度（P＜0.01），临床分期（P＜0.01）、区域淋巴结转移（P＜0.05）有关。SNHG7表达被抑制后，BGC823细胞增殖能力下降，细胞凋亡率增加（P＜0.01）。 结论 SNHG7在胃癌组织中显著高表达，有望成为预测胃癌预后的标记物。

胃癌；长链非编码RNA；SNHG7；增殖，凋亡

胃癌是一种严重危害人类生命安全的常见恶性肿瘤，晚期胃癌患者5年生存率不足10%，胃癌复发和转移是其致死的主要原因，故发现调控胃癌细胞侵袭和迁移的相关基因，并寻找新的胃癌特异性生物标志物和药物靶点迫在眉睫[1]。随着对长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）了解的深入[2，3]，越来越多的lncRNA被证实在胃癌中存在异常表达，具有甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、剪接、转录及翻译调控等多种生物学功能，与胃癌发生、发展密切相关。本课题组在对基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中的芯片数据GSE51575进行了基因重注释分析，发现差异表达在2倍以上的lncRNA有20个，其中异常表达的长非编码RNA SNHG7位于人类染色体9q34.3，转录出长为869bp的转录本。基于以上芯片结果，作者对SNHG7作为胃癌潜在分子标志物及其功能进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 组织标本 胃癌细胞系SGC7901、BGC823、MGC803、MKN45及正常胃黏膜上皮细胞GES-1由上海生物细胞库提供，并收集本院2013年1月～2014年12月手术切除并经病理确诊的胃癌标本82例，所有患者术前均未接受抗肿瘤治疗，年龄34～78岁，男49例，女33例。79例行D2淋巴结清扫的根治性胃切除手术，3例行姑息性手术。取距癌组织边缘5cm以上的癌旁组织作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 胎牛血清、DMEM购自Gibco公司；Trizol、LipofectAmine2000试剂购自美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKa Ra公司，CCK-8试剂盒、凋亡试剂盒购自南通碧云天生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程公司按以下序列合成：SNHG7引物序列:上游引物5'-CTAGGGGACTGGGCTGCT-3'，下游引物5'-AGGGTCTTAGGTTCCAGGCA-3'；βactin引物序列：上游引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.2.2 qRT-PCR 按 Trizol说明书要求提取组织总RNA，按qRT-PCR说明书要求配制50μL反应体系，并采用以下条件进行反转录反应: 50℃反转录反应30分钟，92℃反应3分钟变性反转录酶。所得到的cDNA按如下条件进行PCR扩增反应：92℃变性10秒，55℃退火20秒，68℃延伸20秒，扩增40个循环。以β-actin基因作为内参，采用2-△△Ct法计算SNHG7 mRNA相对表达量。

1.2.3 细胞转染 取2×105对数期生长细胞接种于6孔板中，混匀。置于37℃、5%CO2培养箱孵育24小时，将si SNHG7和LipofectAmine2000分别加入Opti-MEM中，轻轻振摇5分钟后混匀，制成转染液，室温静置20分钟后，将转染液加入细胞中，轻轻混匀，孵育6小时后弃去转染液，加10%FBSDMEM继续培养。SNHG7干扰RNA（si SNHG7）及阴性对照 （si SNHG7-N）序列由上海生工公司合成，SNHG7特异性 siRNA （上游引物 5'-CCGATTCTTAAGTTCTGCTATTGTG-3'，下游引物5'-GCTATTGTGGTATTCTGGTGGAGAA-3'。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 将转染SNHG7干扰序列和NC序列的BGC823细胞按5×103/孔接种于96孔板，每组设置6个复孔，于接种后24、48、72和96小时按照CCK8试剂盒说明检测细胞增殖。于450nm波长处测定每组细胞的吸光度值。取6孔平均值为结果（A值），以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞增殖曲线。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将2×105个细胞种于6孔板中，24小时后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集后，1000r/min离心5分钟，弃上清，用预冷的PBS洗涤2次后重悬于75%乙醇，并于-20℃固定过夜，洗涤离心后加入含有10mg/L溴化丙啶（PI）和0.1%R Nase A的PBS液500μL，室温避光染色10分钟后，用流式细胞仪测定细胞凋亡时消化收集细胞，分别加入5μL AnnexinV-FITC和10μL碘化丙啶（PI），混匀。在室温下，避光反应5～15分钟检测细胞凋亡率，以百分数表示细胞凋亡率。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 GEO数据分析 芯片GSE51575分析显示一共有125条lncRNA在胃癌组织中存在差异表达，其中有20条表达升高或下降1倍以上，详见表1。

表1 芯片GSE51575中相对癌旁组织升高或下降1倍以上的lncRNAs

2.2 SNHG7在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达SNHG7在胃癌组织中表达是其癌旁正常组织的2.2倍，基于以上结果，本文采用RT-PCR法检测82例胃癌患者癌组织和配对癌旁组织的SNHG7的表达差异。结果显示，SNHG7在胃癌组织中呈高表达，相对癌旁组织表达量的中位数为3.5倍，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1。体外实验中，胃癌细胞系SGC7901，BGC823，MGC803和MKN45的SNHG7表达均明显高于胃上皮细胞系GES-1（P＜0.01），见图2。其中BGC823细胞SNHG7表达较GES-1细胞升高4.5倍，故本文选择BGC823细胞进行进一步体外实验。

图1 SNHG7在胃癌和癌旁组织中表达

图2 SNHG7在胃上皮细胞和胃癌细胞系中表达

2.3 SNHG7表达水平与胃癌临床病理特征的关系根据SNHG7在胃癌组织中位表达量 （3.5倍），将82例胃癌组织分为SNHG7高表达组（41例）和低表达组（41例）。研究发现，SNHG7的表达与肿瘤的浸润深度、临床分期和区域淋巴结转移有关，而与患者的性别、年龄、肿瘤部位、远处转移及肿瘤大小无明显关系。浸润深度T3～T4患者的SNHG7表达水平明显高于T1～T2患者（P＜0.01）；存在区域淋巴结转移越多的患者SNHG7表达水平明显高于无转移患者 （P＜0.05）；TNMⅢ～Ⅳ期患者的SNHG7表达水平明显高于TNMⅠ～Ⅱ期（P＜0.01），详见表2。

2.4 干扰SNHG7表达对胃癌细胞BGC823增殖和凋亡的影响 胃癌细胞BGC823在siRNA转染后，SNHG7下调明显 （P＜0.01）；与对照组相比，siRNA-SNHG7组细胞72、96小时增殖明显受到抑制 （P＜0.05）；siRNA-SNHG7组细胞凋亡比例为（15.27±2.54）%，明显高于对照组细胞的 （4.14± 0.87）%（P＜0.01），详见图5。

3 讨论

LncRNA为一类长度超过200bp的转录本，由于其自身缺乏明显的开放阅读框架，不参与蛋白质的编码功能，起初lncRNA被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是基因组转录的“噪音”，不具有生物功能。但后续研究显示，lncRNA可通过染色质修饰、转录激活与干扰等参与包括肿瘤在内的多种细胞内信号调控过程[4-5]。lncRNA FENDRR在胃癌组织中表达降低，低表达的患者肿瘤浸润更深，更容易发生局部淋巴结转移，并与FN1、MMP2/MMP9表达改变相关[6]。CCAT1在胃癌中表达上调，该lncRNA可能通过结合到C-Myc启动子区域，促进癌细胞的侵袭、转移能力[7]。以上研究表明LncRNA可能在胃癌的发生、发展中起重要调节作用。

表2 胃癌组织中SNHG7表达与临床病理参数的关系

图3 RT-PCR检测SNHG7在BGC823细胞中的表达量

图4 CCK-8法检测SNHG7抑制后BGC823细胞的增殖

图5 流式细胞仪检测BGC823细胞凋亡（5A：空白载体组；5B:siRNA组）

本研究对芯片GSE51575数据进行了基因重注释分析，发现SNHG7在26例胃癌组织中高表达。本文用RT-PCR法检测了SNHG7在82例胃癌和癌旁组织中表达情况，发现SNHG7在胃癌组织中存在高表达，是癌旁组织表达量的3.5倍。SNHG7表达越高，肿瘤的浸润深度越深，并具有更高的临床分期和更多的区域淋巴结转移，而胃癌浸润至浆膜外、较多的区域淋巴结转移本身就是肿瘤恶性程度高的标志，提示胃癌组织中lncRNASNHG7较高表达患者术后随访和监测应更严密，以防复发。She等[8]研究发现，SNHG7在肺癌组织中存在高表达，抑制SNHG7表达后，可通过增加FAIM2蛋白表达，促进肺癌A549细胞凋亡。本研究体外实验表明，在不同胃癌细胞系中SNHG7表达均较正常胃黏膜上皮细胞GES-1高，与胃癌组织中表达一致。通过siRNA抑制胃癌细胞SNHG7表达后，72、96小时的细胞增殖能力明显下降，而流式细胞仪检测也进一步证明，BGC823细胞SNHG7表达抑制后，凋亡率明显增加，达（15.27±2.54）%，显著高于对照组的 （4.14±0.87）%。通过对GSE51575芯片中数据进行基因富集分析，发现细胞周期及细胞增殖相关的基因富集在SNHG7高表达的患者上，说明SNHG7可能通过抑制凋亡基因或促进增殖相关基因而调控胃癌细胞生长，为下一步研究SNHG7通过何种途径调控胃癌细胞增殖提供理论依据。

综上所述，本研究表明SNHG7在胃癌组织中表达上调，且与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移密切相关，下调SNHG7能够增加胃癌细胞增殖和凋亡。综上所述，SNHG7在胃癌的发生发展中发挥癌基因的作用，有可能用于胃癌患者预后监测和发现新的治疗靶点。

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温州市科技局计划项目（Y20160121）