长岛型掌跖角化病：SERPINB7基因突变位点研究

戴珊，南栩，赵红珊，宋清华，张春雷

（1.北京大学第三医院，北京100191；2.北京大学基础医学院遗传学系，北京100083）

·论著·

长岛型掌跖角化病：SERPINB7基因突变位点研究

戴珊1，南栩2，赵红珊2，宋清华1，张春雷1

（1.北京大学第三医院，北京100191；2.北京大学基础医学院遗传学系，北京100083）

目的报道2例长岛型掌跖角化病，确定其致病基因突变。方法收集患者及其中1例母亲外周血和临床资料，提取基因组DNA，PCR扩增SERPINB7基因8个外显子及其侧翼序列，对扩增产物进行DNA测序以查找基因突变位点。结果2例患者均存在SERPINB7基因c.796C>T杂合突变伴c.455G>T杂合突变，前者可导致编码蛋白质第266位氨基酸出现终止改变（p.R266*），后者可导致第6外显子第1个核苷酸发生改变，使得该外显子的剪接受体位点消失。例1患者母亲为c.455G>T杂合突变而不伴另一突变。正常对照未见这2种突变。结论SERPINB7基因的c.796C>T和c.455G>T突变是引起2例患者长岛型掌跖角化病的原因。

长岛型掌跖角化病；基因；SERPINB7；突变

掌跖角化病（Palmoplantar keratoderma,PPK）是一组以掌跖皮肤过度角化和增厚为主要特征的遗传性疾病。根据形态学和遗传特性可以分为4类：弥漫性，局灶性，条纹状和点状[1]。长岛型掌跖角化病（Nagashima-type palmoplantar keratosis,NPPK, OMIM 615598）属于弥漫性非残毁性掌跖角化病，是一种常染色体隐性遗传病，表现为皮肤红斑基础上轻度角化。Kubo等[2]于2013年将NPPK的致病基因确定在编码丝氨酸蛋白酶抑制因子B亚型7的SERPINB7基因上。目前已报道的NPPK患者主要来自日本，中国及韩国等其他东亚国家仅有数十例病人被报道。笔者在临床上收集到2例中国NPPK患者，并检测其SERPINB7基因突变情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料例1患者为散发病例，男，17岁，出生后数月掌跖部位即出现红斑、脱屑，并逐渐加重扩展，累及手、足背部，腕部及足踝。至青春期后手足出现轻度异味，遇水后发白，伴手足多汗。例2患者男，有家族史，26岁，约2岁时出现掌跖部皮肤潮红、角化，后出现皮肤增厚、脱屑，逐渐加重并进展至手、足背部，高中时手足出现异味，无明显手、足多汗。体格检查：例1患者双手掌、足底、手足背边缘、指趾背侧面、手腕内侧有弥漫性红斑伴角化及脱屑，皮肤轻度增厚，角质层略呈淡黄色，见图1a。同时伴有足踝及跟腱处受累，见图1b。手足部分区域因多汗出现浸渍发白。例2患者双手掌、指趾背侧面、手腕内侧及足底弥漫性红斑，皮肤角化增厚较例1患者更明显，见图1c。手足部数个指甲及趾甲增厚、粗糙，远端变脆、分离。例1患者手足皮肤，指甲及趾甲真菌镜检均呈阴性，例2患者趾甲真菌镜检阳性。2例患者均未见毛发或牙齿异常。既往未规律用药治疗。体健，否认其他器官系统病史。否认父母近亲婚育史。例2患者述其母亲，大姨及外婆有类似病史，见图2。

图1 患者皮损表现

图2 例2患者家系图，坭为先证者

取2例患者手掌皮肤行组织病理学检查，均表现为表皮高度角化，棘层及颗粒层肥厚，真皮浅层轻度淋巴细胞浸润，见图3。

图3 皮损组织病理图（HE染色×100）

1.2 外周血DNA提取本研究经北京大学第三医院伦理委员会批准，患者及其家属签署知情同意书。由于例2患者家属在外地拒绝参加本实验，故取例1患者及其母亲和例2患者外周血各5 mL，EDTA二钠抗凝，用试剂盒提取基因组DNA。

1.3 突变基因的引物合成，PCR扩增及测序分析

1.3.2 PCR扩增PCR反应体系为50μL，模版DNA 1 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL。取5 μL PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 PCR产物测序分析所有PCR产物纯化后送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序方法为Sanger双脱氧链终止法（Sanger法）。测序结果采用Chromas软件与SERPINB7基因组序列进行比对。

2 结果

以患者的基因组DNA为模板，所有引物的PCR产物经凝胶电泳均可见目标条带，产物切胶纯化后测序，结果清晰无杂峰干扰。将所测得的序列与Ensembl数据库（http://www.ensembl.org/index. html）公布的正常序列进行对比，得到如下结果：2例患者SERPINB7第8外显子中第796位核苷酸（从cDNA编码起始位点ATG算起）发生C→T杂合突变（c.796C>T）（dbSNP:rs142859678），导致其编码蛋白质在第266位氨基酸出现终止改变(p. R266*)。第6外显子中第455位核苷酸发生G→T杂合突变(c.455G>T)（dbSNP:rs202182550）。例1患者母亲为c.455G>T杂合突变携带者，而无c.796C> T突变。所有突变均由反向测序得到验证。同时在6例无亲缘关系的正常人中进行此基因直接测序，未发现上述突变，见图4。

3 讨论

NPPK于1977年首先被日本学者描述,当时被认为是Mal de Meleda掌跖角化病一种较轻的临床亚型。随着研究的深入和报道病例的增多，目前认为是新的独立的疾病类型。通常表现为出生时至3岁以内出现掌跖部位弥漫性界清红斑，伴有轻度至中度角化，常累及手足背部，面积通常不超过手足背的一半。腕内侧、踝和跟腱也是好发部位，肘膝部也可受累。遇水后角化皮肤可出现发白改变[2-4]。皮疹稳定,不随年龄增长出现明显进展或加重。患者常伴有手掌和足底多汗,易伴发皮肤浅表真菌感染。组织病理无特异性，表现为表皮角化过度伴角化不全，棘层肥厚，真皮无明显炎症反应。患者一般情况良好，无毛发、甲、牙齿等其他外胚层受累表现，也无其他器官系统受累表现。

a：患者SERPINB7基因c.796C>T杂合突变；b：2例患者和例1患者母亲SERPINB7基因c.455G>T杂合突变；c：例1患者母亲未发现c.796C>T突变；d：正常对照未发现c.796C>T和c.455G>T突变。图4SERPINB7基因突变测序图(箭头指示突变位点)

NPPK需要与Mal de Meleda掌跖角化病、Bothnia型掌跖角化病、进行性对称性红斑角化症等鉴别。Mal de Meleda掌跖角化病相对好发于克罗地亚的梅勒达岛，人群中的发病率是1/100 000。该病是弥漫性掌跖角化病中较严重同时伴侵袭性的类型，同样为常染色体隐性遗传，但其掌跖角化为进展性，随年龄增长逐渐加重，且角化通常更为严重，可累及整个手足背，多伴有甲受累及口周、肛周的红斑角化，可出现自发性断指（趾）和屈曲挛缩[5]；Bothnia型掌跖角化病为常染色体显性遗传，好发于瑞典波的尼亚湾的西部和西北部。尽管临床表现与NPPK较为类似，但是Bothnia掌跖角化可累及至手足背一半的面积，通常多汗更为严重，不累及除手足外的其他部位。可伴有轻度甲改变，而且遇水后角质发白及肿胀更迅速且更明显[6-7]。进行性对称性红斑角化症是一种常染色体显性遗传病,皮损常先对称性发生于掌跖部位，后渐扩展至身体其他部位如手足背、胫前及四肢连接处伸侧面，随着年龄等增长皮损逐渐加重。中国汉族人群少见，目前尚未确定其致病基因。其他需要鉴别的疾病还包括表皮松解性和非表皮松解性弥漫性掌跖角化病。这2种病为常染色体显性遗传，临床表现相同，为掌跖部位弥漫角化，皮损在手腕处边界清晰，无累及伸侧皮肤的倾向。角化程度严重，表现为黄色疣状斑块，常可因皮肤弹性消失而发生皲裂和疼痛，造成手足活动困难，可同时合并指尖部收缩，指节垫及厚甲。病理表现前者为表皮松解性角化过度，后者为非特异性改变。

Kubo等[2]对3例无关日本NPPK患者进行全外显子组测序分析，确定NPPK的致病基因为SERPINB7基因。通过Sanger测序，进一步分析另外10例无关NPPK患者的SERPINB7基因外显子序列，最终发现这13例患者中6例患者存在SERPINB7的c.796C>T纯合突变，另外7例患者为c.796C>T杂合突变伴其他功能缺失性杂合突变。该作者通过千人基因组数据库（1 000 Genomes Project）中SERPINB7基因突变位点的分布情况分析，发现c.796C>T（rs142859678）杂合突变在日本和中国的正常人群中携带频率分别为2/89和6/197，然而该突变位点未见于千人基因组数据库中欧洲及其他非洲裔的正常人群。因此推断，NPPK可能主要流行于亚洲，特别是日本和中国。目前已经报道了40余例病例，其中大部分来自日本。国内报道了16例基因确诊病例[8-9]，3例疑似病例[9]，On等[10]报道了3例韩国病例。所有已知病例中除1例外其他均为c. 796C>T纯合突变或合并其他功能缺失性杂合突变。已经证实该突变存在祖先效应（Founder effect）。目前，共发现了9种其他类型的突变，包括无义，移码，剪接点和错义突变等[2,4,8,11-12]。

本研究中2例NPPK患者均为SERPINB7基因c.796C>T杂合突变合并c.455G>T杂合突变所致。通过千人基因组数据库中SERPINB7基因突变位点的分布情况分析，发现c.455G>T（rs202182550）杂合突变在中国汉族人群中携带频率为1/197，略低于c.796C>T，提示这一突变可能具有潜在的祖先效应[13]。然而，目前报道的合并c.455G>T杂合突变的病例稀少，仅有3例。因此，笔者发现的这2例患者为上述推测提供了进一步的证据。

将本市中医肝胆医院2014年5月~2017年6月收治的心血管疾病患者87例分为观察组和对照组,其中观察组44例,男女比例为25:19,年龄46~75岁,平均年龄(58.4±3.3)岁,病程3个月~18年,平均病程(9.7±1.5)年;对照组43例男女比例为23:20,年龄48~72岁,平均年龄(57.2±3.1)岁,病程5个月~17年,平均病程(8.7±1.9)年,对比两组患者年龄、性别等一般资料(P>0.05)。

SERPINB7基因位于18q21.3，编码丝氨酸蛋白酶抑制因子B亚型7，具有抑制丝氨酸蛋白酶的作用。SERPINB7功能的缺失可能导致NPPK皮损处蛋白酶活性过强[2]。SERPINB7分布于全身表皮，主要表达于颗粒层及角质层上部[14]，但是NPPK主要发生于手掌，足底，肘膝等部位，提示NPPK的发病可能与慢性机械压力有关。因此，SERPINB7可能抑制机械压力诱导的蛋白酶，保护角质形成细胞免于蛋白酶介导的细胞损伤[10]。SERPINB7的活性位点环（Reactive site loop,RSL）位于第331~352位氨基酸，保持该功能区的完整性是维持其活性的基本条件。所有目前已知的突变均会导致该活性位点环的截断,造成NPPK患者表皮内颗粒层和角质层SERPINB7蛋白酶活性抑制作用丧失，表皮内SERPINB7减少，不能有效抑制丝氨酸蛋白酶活性，导致角质形成细胞蛋白降解，角质层屏障功能破坏。水分渗透加速，经表皮水分丢失（TEWL）值较正常皮肤升高，从而引发诸如皮肤肿胀发白等一系列临床表现[2]。既往研究的免疫组化结果提示NPPK皮损处SERPINB7表达显著降低，而影响表皮分化的蛋白如兜甲蛋白，丝聚蛋白的表达则不受影响，提示NPPK患处皮肤并无明显的角质形成细胞分化障碍[2]。其针对的目标蛋白酶和具体致病机制仍有待进一步研究。

NPPK目前仍缺乏国际公认的诊断标准，需要结合患者病史，临床表现和实验室检查综合诊断，并通过基因检测最终明确诊断。尽管被认为可能是日本和我国最常见的掌跖角化病类型，但是作为较新被确认的一种疾病，目前国内对其认识仍然不足，诊断的病例屈指可数。笔者报道的这2例患者病史及临床表现典型，并最终通过基因检测确诊。且这2例患者的突变类型均不同于以往最常被报道的类型。进一步提示除了最常见的c.796C>T外，c.455G>T这一突变位点也可能具有祖先效应，为SERPINB7的功能研究提供了新的思路。

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Nagashima-type Palmoplantar Keratoderma:Mutation Analysis of the SERPINB7 Gene

Dai Shan1,Nan Xu2,Zhao Hongshan2,Song Qinghua1,Zhang Chunlei1
1.Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China;2.Department of Medical Genetics,Peking University Health Science Center,Beijing 100083,China

ObjectiveIn order to report two cases of Nagashima-type palmoplantar keratoderma（NPPK）,and to identify mutations in the SERPINB7 gene.MethodsClinical data were collected from two patients with NPPK and one patient's mother.Peripheral blood samples were obtained from the two patients and one patient's mother.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 8 exons and their flanking sequences of the SERPINB7 gene followed by DNA sequencing.ResultsHeterozygous mutation c.796C>T and c.455G>T were found in both of the two patients.The former one led to the formation of a premature termination codon at amino acid position 266（p.R266*）and the later one caused the change in the first nucleotide of exon 6,leading to an elimination of acceptor-splicing site of this exon.The healthy mother of patient one was a heterozygous carrier of the mutation c.455G>T.However,the two mutations were not found in normal controls.ConclusionThe mutation c.796C>T and c.455G>T in the SERPINB7 gene are responsible for NPPK in the two patients.

Nagashima-type palmoplantar keratosis;Gene;SERPINB7;Mutation

R758.5+3

A

1672－0709（2017）02-0108－05

2016-12-03）

宋清华，E-mail:songqinghua169@163.com