胰岛素致低血糖对糖尿病大鼠脑组织NGF mRNA表达的影响

唐明薇++黎瑶++王风波

[摘要] 目的 观察胰岛素致低血糖对糖尿病大鼠脑组织NGFmRNA表达变化的影响作用。 方法 48只Wistar大鼠按随机数字表法分为对照组（16只）、糖尿病模型组（32只），采用高脂高糖饮食+腹腔注射链脲佐菌素方法制备2型糖尿病大鼠模型，糖尿病模型组随机分为糖尿病非干预组（16只）和胰岛素低血糖组（16只）。胰岛素低血糖组大鼠予胰岛素皮下注射，每日1次，3组大鼠分别于第3、6、9、12天取4只大鼠的脑组织用RT-PCR法检测NGFmRNA。 结果 与对照组比较，糖尿病非干预组和胰岛素低血糖组大鼠脑组织NGF mRNA表达均不同程度下降，胰岛素低血糖组降低最为显著（P < 0.01）。 结论 糖尿病降低了脑组织NGF mRNA表达，而胰岛素致低血糖能使脑组织NGFmRNA表达进一步下降，不利于糖尿病神经病变的再生修复。

[关键词] 胰岛素；低血糖；糖尿病；NGF mRNA

[中图分类号] R587.2；R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0025-04

[Abstract] Objective To observe the effect of hypoglycemia caused by insulin on NGF mRNA expression in rats brain with diabetes. Methods 48 adult Wistar rats according the random number table method were divided into control group （16 rats） and diabetes model group （32 rats）. High fat and sugar dietase combinated + Streptozotocin intraperitoneal injection were used for making type 2 diabetes model. The diabetes model group was randomly divided into diabete non- intervention group （16 rats） and hypoglycemia caused by insulin group （16 rats）. The rats in hypoglycemia caused by insulin group were injected insulin subcutaneously， once per day，. the brain tissues of 4 rats in 3 groups were detected NGF mRNA by the RT-PCR at 3rd， 6th， 9th and 12th day. Results Compared with control group， the expression of NGF mRNA in the brain tissues of diabete non- intervention group and hypoglycemia caused by insulin group were decreased at different degrees （P < 0.01）， the hypoglycemia caused by insulin group was the most obvious （P < 0.01）. Conclution Diabetes can effectively reduce the expression of NGF mRNA in brain tissue， hypoglycemia caused by insulin can make the expression of NGF mRNA further decreased， it is not conducive repairing diabetic neuropathy.

[Key words] Insulin； Hypoglycemia； Diabetes； NGF mRNA

据流行病学调查，我国成年糖尿病患病率约为9.7%，总数超过9240万例，2型糖尿病占糖尿病总数90.0%以上，患病率呈快速上升的趋势，其原因可能与我国较快发展的城市化、生活方式改变等因素有较大关系[1]。作为最常见并发症之一，糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）在2型糖尿病患者中发病率高达60.0%以上，重者可致患者残疾，对糖尿病患者的身心健康是十分不利的。研究表明DPN的发病机制与神经生长因子（nerve growthfactor，NGF）及其受体的变化及缺失关系密切，有效控制血糖则有利于DPN患者NGF的表达[2]。胰岛素注射是治疗糖尿病的常规手段，优点与缺点同样突出，其主要缺点就是低血糖反应发生率较高，众所周知，低血糖反应的危害效应远较高血糖快而重，輕者即可损害神经系统结构与功能，十分不利于DPN的再生修复。本研究采用胰岛素注射致糖尿病大鼠低血糖反复发作，观察不同时间点糖尿病大鼠脑组织NGF mRNA的表达情况，从而以NGF的角度进一步探讨胰岛素致低血糖对糖尿病患者神经系统病变的影响作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

48只成年雄性健康Wistar大鼠，体重250～300 g（由成都大学动物实验中心提供，合格证号SYXK（川）2015-196）；胰岛素注射液（北京赛生）；RT-PCR试剂盒（武汉博士德）；链脲佐菌素（Sigma公司）；Trizol、DEPC（Gibco公司）；引物合成（上海博亚生物）；血糖仪（罗氏）。

1.2 分组及糖尿病造模

48只健康雄性Wistar大鼠室温25℃左右适应性饲养7 d，按随机数字表法分为糖尿病模型组（32只）、正常对照组（16只），模型组又随机分为胰岛素致低血糖组（16只）、糖尿病非干预组（16只）。参照文献[3-4]糖尿病大鼠模型制备方法：高脂高糖饲料（其中20.0%蔗糖，15.0%猪油，3.0%胆固醇，1.0%胆酸盐）喂养1个月，予腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的25 mg/kg链脲佐菌素，注射前禁食12 h，3 d后取尾静脉血测得随机血糖>16.7 mmol/L示糖尿病模型制备成功。对照组大鼠腹腔仅注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，普通饲料常规饲养。

1.3 胰岛素注射

糖尿病模型制备成功后第4天开始皮下注射胰岛素，胰岛素致低血糖组大鼠术前禁食12 h，予普通胰岛素注射液0.4 U/kg皮下注射，1次/d，共12 d。低血糖反应标准[5]：肢体抽搐，反应明显迟钝甚至昏迷，血糖≤2.8 mmol/L，20 min后灌胃10%葡萄糖水1 mL，低血糖反应缓解或消除。对照组及糖尿病非干预组大鼠皮下注射同等剂量生理盐水。三组大鼠分别于开始胰岛素注射后第3、6、9、12天各取4例的脑组织，以低血糖反应20 min左右取脑为宜，取脑大鼠不予灌胃葡萄糖水。

1.4 RT-PCR法NGF mRNA检测

根据RT-PCR试剂盒说明以Trizol法提取大鼠脑组织总RNA。RT-PCR检测法参考文献[6]方法及试剂盒说明：逆转录为cDNA，94℃预变性5 min、94℃变性55 s、57℃退火45 s、72℃延伸50 s，共35个循环，以72℃终末延伸8 min；NGF上游引物序列为5′-GAT？鄄CGGCGTACAGGCAGAAC-3′，下游引物序列5′-GGCT？鄄CGCCACTTGGTCTCGA-3′；β-actin上游引物序列为5′-GGTGAAGGTGGGTGGCAA-3′，下游引物序列5′-TTCCCATTCTCAGCCTTAAC-3′。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

糖尿病大鼠在造模成功后第2～3天开始出现不同程度的多饮多食多尿、消瘦、精神状态较差、行动迟缓等现象。胰岛素致低血糖组大鼠低血糖反应发作时出现肢体抽搐、反应迟钝甚至昏迷现象，血糖明显降低，经灌胃葡萄糖水后低血糖症状虽有缓解，但精神状态更差。三组大鼠均以胰岛素致低血糖组大鼠低血糖反应发作后20 min为血糖监测时间点。与对照组相比，糖尿病非干预组大鼠血糖显著升高（P < 0.01），胰岛素致低血糖组血糖显著降低（P < 0.01）；与糖尿病非干预组相比，胰岛素致低血糖组血糖显著降低（P < 0.01）；胰岛素致低血糖组大鼠组内比较，第12天血糖低于第3天，差异有统计学意义（P < 0.05），对照组及糖尿病非干预组大鼠组内比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 三组大鼠脑组织RT-PCR法NGFmRNA检测情况

与对照组比较，糖尿病非干预组和胰岛素致低血糖组大鼠脑组织NGF mRNA表达均明显下降（P < 0.01），而胰岛素致低血糖组较糖尿病非干预组进一步降低（P < 0.01）；不同时间点比较，胰岛素致低血糖组大鼠第12天明顯低于第3天，差异高度统计意义（P < 0.01），糖尿病非干预组12 d低于3 d，差异有统计意义（P < 0.05）；对照组各时间点比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

DPN是2型糖尿病患者发病率很高的并发症，十分不利于糖尿病患者身心健康，尽管DPN的发病机制目前仍然未能完全阐明，但已有研究证实DPN的发病与NGF及其受体的改变与缺失密切相关[2]。NGF是神经营养因子家族中的主要成员之一，又称神经诱向因子，是一种从生物体组织中提取而来的生物活性分子，具有维持神经细胞生长发育及繁殖的作用，与神经细胞的生长、存活密切相关，对维持神经系统的发育及正常神经功能表达不可替代的作用[6]。NGF与特异性受体TrkA相结合发挥出提升神经细胞存活率及促进神经突触生长两方面生物活性，促进神经元修复并减少神经细胞凋亡，对神经系统的生长发育和神经轴突的再生修复均担负着举足轻重的作用[7]。高岭等[8]给予缺血缺氧性脑病新生儿出生6 h内常规治疗加NGF肌注，每日1次，连续14 d，用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测到患儿血清酸性钙离子结合蛋白S-100和髓鞘碱性蛋白MBP均明显下降，神经行为功能评分提高，而检测血清S-100和MBP水平是临床上常用判断脑损伤程度的有效指标，水平越升高表示脑损伤越严重，反之亦然。DPN的主要病理改变是神经纤维轴突变性、髓鞘皱缩或脱髓鞘、髓鞘再生致郎飞结节间长度改变，NGF及其受体的异常改变对DPN的病程演变起着重要的推动作用，无论是NGF合成障碍，逆向轴浆运输能力降低，仰或受体TrkA的表达异常，均可明显影响到受损神经的修复、再生[9]。糖尿病患者血糖波动次数越多幅度越大，其神经病变越严重，严重程度与血糖波动水平呈正相关，如果在调控血糖过程中频繁发作低血糖，对神经系统的损害也更加明显，这种损害作用对中枢神经和周围神经系统都是显著的，平均血糖的波动增加可致周围神经传导速度减慢，并可引起痛觉敏感，甚至造成神经血管损伤[10]。研究发现血糖大幅度波动时IGF-1分泌增加，加剧周围神经炎性反应及氧化应激，血NGF水平降低，神经细胞损伤修复能力下降，故糖尿病低血糖患者存在神经损害因素及神经修复能力的双重受损，易发生周围神经病变[10-11]。大脑中动脉栓塞致脑梗塞的糖尿病大鼠脑皮质缺血区NGF表达水平低于非糖尿病脑梗塞组，而细胞凋亡数高于非糖尿病组，提示糖尿病患者更易并发脑梗塞，血管病变同时存在代谢障碍，易出现严重的神经功能病变，治疗更加困难，康复效果较差[12-13]。有实验研究发现，糖尿病模型大鼠膀胱和骶髓神经节NGF表达与对照组大鼠相比明显降低，膀胱阈容量增加，排尿效率明显减少，残余尿量明显增多[14]。有研究表明2型糖尿病大鼠下颌下腺NGF表达显著降低，连续注射胰岛素使血糖得到有效控制后下颌下腺NGF阳性反应明显增强，可接近或达到正常水平[15]。郭学敬等[16]观察到糖尿病大鼠腰骶部神经髓鞘变性脱落，神经胞浆及胶质变性，经注射NGF和胰岛素治疗4周后，糖尿病大鼠膀胱和腰骶神经节中NGF含量明显增加，膀胱逼尿肌和腰骶神经元超微结构显著改善，表现为膀胱逼尿肌细胞外形规整，走行一致，细胞间连接紧密，细胞内线粒体大小形态无明显异常，腰骶神经髓鞘分布均匀，呈同心圆状，胞浆、神经胶质基本正常，神经变性情况显著改善，优于单纯胰岛素或鼠神经生长因子治疗，说明有效控制血糖有利于增加神经系统NGF的表达，促进DPN恢复。

低血糖是临床上糖尿病控糖治疗过程中的常见不良反应。经统计学分析得出，文化程度、糖尿病并发症教育、定期复查、是否有过低血糖发生及发生次数是患者了解低血糖知识程度的相关影响因素，尤其是胰岛素注射降糖方案，由于缺乏规范使用胰岛素的良好认识，许多患者常有低血糖反应发生，甚至不乏频繁的低血糖发作案例[17]。低血糖反应对患者的危害快而重，轻度发作便可致神经系统损害，对包括DPN在内的神经病损再生恢复是非常不利的，低血糖对脑组织的损害通常不是由于能量缺乏直接引起的病变过程，而是低血糖后葡萄糖再灌注所带来的连锁生化反应和兴奋性因子的释放所导致[18]。反复发作的低血糖反应可明显增高糖尿病大鼠海马区p-PKA表达水平，提示反复低血糖可影响糖尿病患者认知功能[19]。有研究发现胰岛素诱导低血糖大鼠海马区Nogo-A表达降低，低血糖后葡萄糖再灌注进一步加重了Nogo-A表达下降现象，凋亡细胞数显著增多，说明低血糖后葡萄糖再灌注可加重中枢神经系统损伤效应，为临床低血糖发作常用的补糖法指出了商榷之处[20]。临床上糖尿病住院患者常采用强化胰岛素治疗方案，能够快速的控制血糖，但低血糖发生率高达36%，超过常规治疗的3倍，门诊患者多使用预混胰岛素，但常缺乏规范的血糖监测，低血糖的发生率亦是较高的，且随着年龄增大而升高，后果越严重[21]。另外，也有研究显示胰岛素治疗致低血糖的糖尿病患者焦虑度明显上升，给患者带来生理上的不适和心理困扰，相较于男性，女性对于这种困扰可能感受更为深刻[22-23]。本实验采用普通胰岛素皮下注射强化降糖致2型糖尿病大鼠反复发作低血糖反应，观察到胰岛素致低血糖组大鼠脑组织NGF mRNA的表达水平较糖尿病非干预组更低（P < 0.01），并随着时间逐渐加重，虽然糖尿病非干预组大鼠脑组织的NGF mRNA表达也呈逐渐降低表现（P < 0.05），但低血糖组的下降更为明显（P < 0.01），说明强化胰岛素治疗致反复低血糖发作可严重影响到脑组织NGF的合成及表达，加重了糖尿病性神经病变程度，严重妨碍了神经系统的再生修复，对提高临床强化胰岛素治疗糖尿病过程中致低血糖的警惕性提供了进一步的参考依据。

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（收稿日期：2016-12-22 本文编辑：苏 畅）