响应面法优化巴旦木总黄酮提取工艺研究

梁鹏举，姜建辉，*，陈敏

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室，新疆阿拉尔843300）

响应面法优化巴旦木总黄酮提取工艺研究

梁鹏举1，2，姜建辉1，2，*，陈敏1，2

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室，新疆阿拉尔843300）

在单因素试验的基础上，利用响应面法对巴旦木总黄酮提取工艺进行优化。巴旦木总黄酮最佳提取工艺条件为：提取时间为60min，料液比1∶21（g/mL），乙醇体积分数73%。理论预测值为4.093mg/g，实际测量值为4.090 mg/g。实际优化的工艺条件与理论预测拟合程度高。

巴旦木；响应面；总黄酮；提取

巴旦木又名巴旦杏（Amygdalus communis L.），因其形扁如桃，又名扁桃，维吾尔语为巴旦姆，英文名Almond tree，蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）乔木，是世界重要干果及木本油料树种之一[1]。巴旦木营养价值极高，为不可多得的滋补佳品，有“圣果”之称，是维吾尔族最重要的干果品种，已成为南疆尤其是喀什和田地区的重要农副产品。由于林果业作为南疆经济发展的重要抓手之一，巴旦木又是南疆最重要的果树品种，对巴旦木的研究日益成为热点[2-5]，但对巴旦木黄酮的研究还鲜见相关报道。以新疆喀什产巴旦木为原料，用醇提法研究了其总黄酮的提取工艺，利用单因素和响应面对提取工艺进行优化，通过试验数据分析旨在为巴旦木产业的综合发展和高价值加工提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巴旦木：采购于新疆阿拉尔市江泰市场干果店，巴旦木果仁烘干去皮、粉碎、过40目筛，收集备用；芦丁对照品（生物纯、纯度≥95%）：上海蓝季科技发展有限公司；石油醚、氢氧化钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠（分析纯）：上海试剂一厂；蒸馏水。

1.2 仪器与设备

标准检验筛：上虞市仪器设备厂；HHS电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；AL104电子天平：上海恒平科学仪器有限公司；UV2400紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SK1515电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；TD5Z医用离心机：湖南凯达科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取巴旦木总黄酮的工艺流程

巴旦木干燥→粉碎（过40目筛）→石油醚脱脂→称取1.0 g→在一定的提取时间、料液比、乙醇体积分数、提取温度条件下进行提取→抽滤→离心→定容→待测液。

1.3.2 测定波长的选择及标准曲线的绘制

参考姜建辉等[6]方法选择最佳波长，以芦丁的质量浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。做回归处理，得回归线方程为[7]y=8.500 0x+ 0.034 1，R2=0.999 6，线性范围为8 μg/mL～40 μg/mL。标准曲线图见图1。

图1 标准曲线图Fig.1Standard curve of rutin

1.3.3 总黄酮含量的计算

由标准曲线得到样品溶液的浓度，再根据浓度计算总黄酮的含量：总黄酮提取量/（mg/g）=C×V×n/W。式中：C为标准曲线上获得的浓度，mg/mL；V为黄酮提液的体积，mL；n为稀释倍数；W为巴旦木粉末重量，g。

1.3.4 单因素试验

准确称取巴旦木粉末1.0 g，置于圆底烧瓶中，以提取时间、料液比、乙醇体积分数、提取温度分别为单因素[8]，研究不同单因素对巴旦木总黄酮提取量的影响。

1.3.4.1 提取时间对巴旦木总黄酮提取量的影响

准确称取巴旦木粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、料液比1∶20（g/mL）、提取温度70℃，提取时间为30、45、60、75、90 min的条件下进行提取。

1.3.4.2 料液比对巴旦木总黄酮提取量的影响

准确称取巴旦木粉末1.0 g，固定乙醇体积分数为70%、确定最优的提取时间、提取温度70℃，在料液比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）的条件下进行提取。

1.3.4.3 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

准确称取巴旦木粉末1.0 g，确定最优的提取时间、提取温度70℃、最优的料液比，在乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%的条件下进行提取。

1.3.4.4 提取温度对总黄酮提取量的影响

准确称取巴旦木粉末1.0 g，确定最优提取时间、最优体积分数、最优料液比，在提取温度分别50、60、70、80℃的条件下进行提取。

1.3.5 响应面试验

用Design-Expert软件处理数据，根据单因素试验结果，利用Box-Behnken中心组合试验设计原理[9]，选取提取时间（A）、料液比（B）、乙醇体积分数（C）为试验因素，以总黄酮提取量为响应值，进行试验设计，响应面因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素水平Table 1Designed of the response surface of level of factor

1.3.6 巴旦木总黄酮提取的重复性试验

验证通过试验选定的最佳工艺重复性[6]，分别准确称取6份巴旦木粉末1.0 g，以上述过程选定的最佳提取工艺条件分别进行6次平行试验，显色及测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间

提取时间对提取量的影响如图2所示。

图2 提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.2Effect of extraction time on the flavones

巴旦木总黄酮的提取量是随时间的增加呈现先增加后减少的变化。这可能是由于随着提取一定时间的增加，黄酮类化合物已基本被提取出来，继续延长提取时间，黄酮结构可能被破坏，并导致提取量下降[10]。由图可知，总黄酮提取时间确定在60 min时提取量最高。

2.1.2 提取料液比

料液比对提取量的影响如图3所示。

图3 料液比对总黄酮提取量的影响Fig.3Effect of solid to liquid ratio on the flavones

巴旦木总黄酮的提取量在料液比1∶20（g/mL）时提取量最大。料液比反映了质量浓度差，质量浓度差越大，样品中的黄酮溶出就越多，越有利于提高提取率。但是随着溶剂用量的增大，提取量没有增加，反而出现下降，并且会消耗大量的溶剂。故料液比1∶20（g/mL）为宜。

2.1.3 乙醇体积分数

乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响如图4所示。

图4 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.4Effect of the volume fraction of ethanol on the flavones

巴旦木总黄酮提取量在乙醇体积分数为50%时得率较低，巴旦木总黄酮提取量随着乙醇体积的增大而增加，当无水乙醇增大到体积分数达70%时，巴旦木总黄酮的提取量也最高，继续增加无水乙醇体积分数时巴旦木总黄酮提取量成直线下降趋势，无水乙醇体积分数高达90%时巴旦木总黄酮提取量最低。其原因可能是相似相溶原理，极性越接近溶解度越大，在乙醇浓度为70%时溶剂的极性和黄酮的极性最为接近。故乙醇体积分数70%为宜。

2.1.4 提取温度

提取温度对总黄酮提取量的影响如图5所示。

图5 提取温度对总黄酮提取量影响Fig.5Effect of extraction temperature on the flavones

温度较低时所得巴旦木总黄酮的量较少，当温度逐渐升高，巴旦木总黄酮提取量随温度的变化呈近似于线性的趋势逐渐增大，80℃时总黄酮提取量最大，这时提取液已沸腾，继续升高温度提取液的温度也不会随之升高，故最佳提取温度选为80℃。

2.2 最佳提取工艺的研究

利用Box-Behnken组合设计原理，采用Design-Expert 8.0.6.1软件[11]，根据单因素试验结果选取提取时间（A）、料液比（B）、乙醇体积分数（C）作为自变量，以巴旦木中所提取总黄酮量为响应值。表2为试验方案的设计和数据处理结果，表3为数据方差分析结果。

2.2.1 响应面试验方案的设计和计算结果

响应面试验设计和结果见表2。2.2.2响应曲面分析

表2 响应面试验设计和结果Table 2Designed and experiment result of response surface

续表2 响应面试验设计和结果Continue table 2Designed and experiment result of response surface

对表2结果用Design-Expert 8.0.6.1软件进行统计分析，得二次回归方程模型为：

表3 回归方程方差分析Table 3Variance analysis of the equation of fitted regression model

由表3可知，回归方程拟合检验p＜0.000 1为高度显著，失拟项p=0.148 9＞0.05不显著，相关系数R2= 0.989 3，调整系数R2Adj=0.975 6，表明试验结果和数学模型拟合度高，可用该模型预测试验结果。CV（变异系数）=1.33%，说明模型精确度高，重现性好，试验可信。可用此模型对巴旦木总黄酮提取进行预测。

通过模型的回归方差分析（表3）可以看出，一次项B、C对粗提取率的影响显著，二次项A2、B2对试验结果影响高度显著，C2对试验结果影响极显著，AB、AC、BC交互效应不显著。从F值可知，巴旦木中总黄酮提取量受料液比、乙醇体积分数和提取时间的影响关系为：料液比＞乙醇体积分数＞提取时间。提取时间、料液比、乙醇体积分数对总黄酮提取量影响的响应曲面图见图6。

图6 提取时间、料液比、乙醇体积分数对总黄酮提取量影响的响应曲面图Fig.6Responsive surfaces showing the effects of extraction temperature，solid to liquid and volume fraction of ethanol on the extraction yield of Amygdalus communis L.flavonoids

图6是通过Design-Expert软件以表2的试验结果和响应方程所绘制的响应曲面图，直观地描述了两因素间的交互作用[13]。响应面图中图形坡度越大代表相互作用越大，反之则越小[14]。由图6分析可知，两两因素间对响应值均有一定的交互作用，但交互作用相对较弱，其中AB的交互作用较为明显，但未到显著。

通过响应面分析得到乙醇溶液提取巴旦木总黄酮的最优工艺条件为提取时间60.32 min，料液比1∶20.89（g/mL），乙醇体积分数72.80%，提取温度80℃，在此条件下巴旦木总黄酮提取量理论值为4.093 mg/g。考虑具体试验，将其最佳工艺条件优化为提取时间60 min，料液比1∶21（g/mL），乙醇体积分数73%，提取温度80℃，在此条件下测得巴旦木中总黄酮的提取量高达4.090 mg/g，总黄酮提取量与巴旦木中总黄酮量的理论值相差较小，二者吻合性好，这很好的说明该模型的预测值与实际提取值具有良好的拟合度，可用该模型预测巴旦木总黄酮的提取，方法可靠、结果准确。

2.2.3 重复性试验

按选定的最优条件及试验参数进行了6次重复性平行试验，在吸光度为0.313时，巴旦木总黄酮的平均提取量达4.093 mg/g，RSD为0.52%（n=6）。该工艺对从巴旦木中提取总黄酮的试验重复性好。

3 结论

通过单因素试验及响应曲面分析方法对巴旦木中总黄酮的提取工艺条件进行了优化，结果表明模型与试验结果拟合度好，误差小，能够较好地预测巴旦木总黄酮的提取率，该方法准确可靠。确定巴旦木总黄酮提取的最佳工艺条件为提取时间60 min，料液比1∶21（g/mL），乙醇体积分数73%，提取温度80℃，在此最优条件下，从巴旦木中提取总黄酮的理论值为4.093 mg/g，实际测得4.090 mg/g，与理论值比较吻合。

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Optimization of Extraction Technique of Total Flavonoids from Amygdalus communis L. Seed Kernel via Response Surface Methodology

LIANG Peng-ju1，2，JIANG Jian-hui1，2，*，CHEN Min1，2
（1.College of Life Sciences，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China；2.Engineering Laboratory of Chemical Resources Utilization in South Xinjiang of Xinjiang Production and Construction Crops，Alar 843300，Xinjiang，China）

On the basis of mono-factor tests，the extraction technology of total flavonoids from Amygdalus communis L.seed kernel was optimized by response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time of 60 min，the solid-liquid ratio of 1∶21（g/mL）and the ethanol concentration of 73%．The predicted and actual yields of total flavonoids from Amygdalus communis L.seed kernel were 4.093 mg/g and 4.090 mg/g accordingly.The actual optimized conditions for polysaccharides extraction from Amygdalus communis L.seed kernel had a high fitting with theoretical prediction indicating its reliability.

Amygdalus communis L.seed kernel；response surface methodology；total flavonoids；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.012

2016-08-13

国家自然科学基金（31160074）

梁鹏举（1984—），男（汉），讲师，硕士，主要从事天然产物化学研究。

*通信作者：姜建辉，副教授，主要从事天然产物化学研究。