氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纤维化中的保护作用

肖小荣++陈思伟++詹兰芬++罗金明++李祥

[摘要] 目的 研究盐酸氨溴索注射液（氨溴索）对百草枯（PQ）中毒肺纤维化的影响及相关机制。 方法 将105只SD大鼠随机分为5组：正常对照组（NC组）、百草枯中毒组（PQ组）、氨溴索普通剂量治疗组（PN组）、氨溴索大剂量治疗组（PL组）、氨溴索超大剂量治疗组（PE组），采取腹腔注射法构建动物模型：NC组注射1.25 mg/kg生理盐水；PQ组注射25 mg/kg 2%PQ溶液；PN组注射25 mg/kg 2%PQ溶液+30 mg/（kg·d）氨溴索；PL组注射25 mg/kg 2%PQ溶液+50 mg/（kg·d）及PE组注射25 mg/kg 2%PQ溶液+90 mg/（kg·d）。在模型建立后21 d处死动物，肺组织行HE和Masson染色分别观察炎症以及纤维化情况；ELISA法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-6（IL-6）含量，q-PCR和Western blot分别测定肺组织中组织金属蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白的表达。 结果 NC组肺组织正常，百草枯模型组大鼠肺损伤和肺组织胶原沉积明显。各剂量氨溴索治疗均能显著减少百草枯中毒诱导的大鼠肺组织胶原沉积，同时伴有IL-6、TIMP-1和TNF-α表达的显著下降（P < 0.05）。在氨溴索治疗各组中，与PN组相比，大剂量治疗和超大剂量治疗更能够抑制百草枯中毒诱导的大鼠肺纤维化（P < 0.05），降低肺组织IL-6、TIMP-1和TNF-α的表达（P < 0.05）。结论 氨溴索可减轻大鼠百草枯中毒所致的肺纤维化，有望成为治疗百草枯中毒所致肺纤维化的有效方法。

[关键词] 氨溴索；百草枯；肺纤维化；白介素-6；基质金属蛋白酶抑制因子1；肿瘤坏死因子α

[中图分类号] R595.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（a）-0035-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of ambroxol on paraquat-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods 105 SD rats were randomly divided into five groups， NC group treated with 1.25 mg/kg normal saline， PQ group treated with 25 mg/kg 2% paraquat， PN group treated with 25 mg/kg 2% paraquat+30 mg/（kg·d） ambroxol， PL group treated with 25mg/kg 2% paraquat+50 mg/（kg·d） ambroxol， PE group treated with 25 mg/kg 2% paraquat+90 mg/（kg·d） ambroxol. The rats were kiiled on 21 d after modeling， the degrees of acute pulmonary injury and fibrosis were detected by HE staining and Masson staining； the mRNA and protein expressions of TIMP-1 and TNF-αwere evaluated by real-time qPCR and Western-blot respectively. Results The lung tissue was normal in NC group， while it showed that significant injury of lungs， fibrosis and large collagen deposition in PQ group. After ambroxol treatment， fibrosis and large collagen deposition reduced， expression of IL-6， TIMP 1-and TNF-α increased （P < 0.05）. Among ambroxol treatment group， compared with PN group， ambroxol at high or large dose could restrained more significantly paraquat poisoning inducing fibrosis and large collagen deposition in rats （P < 0.05）， and reduced expression of IL-6， TIMP 1-and TNF-α （P < 0.05）. Conclusion Ambroxol treatment alleviates paraquat poisoning-induced lung fibrosis. Ambroxol might be a promising way to treat araquat poisoning-induced lung fibrosis.

[Key words] Ambroxol； Paraquat； Lung fibrosis； IL-6； TIMP-1； TNF-α

百草枯中毒可出現严重急性肺损伤及进行性肺间质纤维化，目前尚无特效解毒药[1-2]。研究表明氨溴索能降低细胞内白介素-6（IL-6）、组织金属蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子以及促使肺泡表面活性PS物质的合成减轻百草枯造成的急性肺损伤[3]。氨溴索能降低百草枯中毒所致的早期急性肺损伤，但其抑制百草枯中毒后期的肺纤维化效果以及相关的机制还不清楚。研究表明细胞因子IL-6、TIMP-1和TNF-α参与了肺纤维化的发展[4-7]。因而，本研究观察不同剂量氨溴索干预对急性百草枯中毒大鼠肺损伤后肺纤维化的影响并阐述其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂、药品及仪器

105只6周龄、体重250～310 g的SPF级SD雄性大鼠购自温州医科大学实验动物中心[合格证号：SCXK（浙）2010-0044]。本研究经温州医科大学附属黄岩医院伦理委员会批准。按常规饲养条件，在氨溴索干预后第21天，予腹腔注射2%利多卡因2 mL处死大鼠。主要试剂及药品：氨溴索（批号：20090043），德国柏林格殷格翰医药公司；脂质体、荧光素酶活性检测试剂盒，美国Promega公司；Trizol试剂、逆转录试剂，Invitrogen公司；TaqMan miRNA检测试剂盒，美国ABI公司；TIMP-1抗体（批号ESAP10803）TNF-α抗体（批号110520），美国Novus Biologicals公司；实时荧光定量9700 PCR分析仪，美国ABI公司产品。

1.2 动物分组及百草枯中毒模型建立

根据随机数字表分组原则，105只大鼠随机分为5组，即：正常对照组（NC组）5只，百草枯中毒組（PQ组）、氨溴索普通剂量治疗组（PN组）、氨溴索大剂量治疗组（PL组）以及氨溴索超大剂量治疗组（PE组）各25只。NC组按1.25 mg/kg一次性腹腔注射生理盐水；PQ组：按25 mg/kg一次性腹腔注入2%PQ液，建立大鼠PQ中毒模型；氨溴索治疗组：在PQ中毒模型成功后分别给予腹腔注射氨溴索，剂量分成30 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）以及90 mg/（kg·d）。本研究根据前期实验结果及既往研究结果[8]，30 mg/（kg·d）组染毒后21 d大鼠行为、体重的变化及肺组织纤维化的病理改变，均符合百草枯中毒的特征，且在观察期内未出现死亡，故以30 mg/（kg·d）的剂量作为建立模型的合适剂量。以出现饮食明显减少，静伏少动，逐渐出现目光呆滞，反应迟钝，尿量减少，甚至明显呼吸急促等典型的百草枯中毒的特征作为建模成功的标准。

1.3 BALF以及肺组织的收集

处死大鼠后完整取出肺脏，气管分叉处结扎右主支气管，取出右肺组织，保存在-80℃冰箱以备用mRNA和蛋白测定；左肺给予冰生理盐水灌洗（2.5 mL×3次），回收BALF，进行低温离心（2500 r/min，离心3～5 min），取上清液，保存在-80℃度冰箱以备用；后左肺以10%中性甲醛溶液固定。

1.4 ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的浓度

取出上述BALF标本上清，ELISA法检测BALF中IL-6的浓度，操作具体按试剂盒说明进行。

1.5 HE染色半定量评价肺损伤程度及Masson染色评价肺纤维化程度

甲醛溶液固定的左肺组织，分别进行HE染色及Masson染色。采用Mikawa评分[7]方法：①肺泡充血；②出血；③间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡间隔增厚或透明膜形成。按病变轻重，分为0～4分（0分为无或极轻微损伤；1分为轻度损伤；2分为中度损伤；3分为重度损伤；4分为极重度损伤），总分作为病理评分。

Fulmer评分[8]来半定量肺纤维化：0级，无纤维化，得0分；Ⅰ级：轻度纤维化，受累面积<10%，得1分；Ⅱ级：中度纤维化，病变范围占全肺的10%～25%，得2分；Ⅲ级：重度纤维化，病变范围占全肺的26%～40%，得3分；Ⅳ级：极重度纤维化，病变范围>40%，得4分；每组切片观察4个高倍镜，最后取平均值为肺纤维化得分。

1.6 qRT-PCR法检测肺组织TNF-α和TIMP-1的mRNA表达

运用qRT-PCR法检测右肺组织中TNF-α和TIMP-1的mRNA表达，具体按试剂盒说明进行。TNF-α和TIMP-1表达的相对值=2-△△Ct。TNF-α引物：（F）5'-GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3'和（R）5'-TGT？鄄GGGTGAGGAGCACATAG-TC-3'；TIMP-1引物：（F）5'-ATCGCTCTGGTAGCCCTTCT-3'和（R）5'-TCCCA？鄄GA- AATCATCGAGAC-3'。以U6为内参，每组实验重复3次。

1.7 Western blot检测组织TNF-α和TIMP-1蛋白的表达

采用Western blot检测右肺组织中TNF-α和TIMP-1蛋白的表达情况，具体按试剂盒说明进行。以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究中除NC组外，各组大鼠均出现不同程度典型的百草枯中毒的特征，各组实验过程中均无大鼠死亡。

2.1 氨溴索干预对大鼠肺损伤及肺纤维化的影响

HE染色结果（图1A，封三）显示：NC组大鼠肺组织形态学未见明显改变，而PQ组肺炎性损伤改变明显。与模型组相比，PN组降低了肺损伤程度，但无统计学意义；PL组和PE组均不同程度减轻肺损伤程度（P < 0.05）。见表1。

Masson染色结果（图1B，封三）显示，在NC组肺组织中基本没有胶原沉积，PQ组表达最高；氨溴索治疗后均不同程度的降低（P < 0.05）；在氨溴索治疗组中，与PN组相比，PL组和PE组更能够降低Fulmer评分（P < 0.05）。见表1。

2.2 氨溴索对百草枯中毒肺纤维化SD大鼠BALF中IL-6表达的影响

ELISA结果显示：各实验组IL-6的浓度均有不同程度升高 （P < 0.05），PL组和PE组能明显降低百草枯中毒所导致的IL-6的水平（P < 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠TNF-α、TIMP-1 mRNA与蛋白的表达

Western blot结果表明，各实验组TNF-α和TIMP-1的mRNA与蛋白表达均显著升高（P < 0.05）；各剂量氨溴索均能显著降低TNF-α和TIMP-1的表达（P < 0.05）；在PL组和PE组两组中，TNF-α和TIMP-1的表达无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

百草枯中毒大鼠肺的病理改变包括早期急性肺炎和后期肺纤维化，炎性细胞的浸润和炎性因子的释放是其重要的病理特征，IL-6、TNF-α和TIMP-1等细胞因子在肺纤维化的发病及病理过程中的作用已引起广泛的重视[4，9]。笔者发现，在百草枯中毒后第21天后，大鼠肺组织不仅存在肺损伤，同时伴有肺组织大量胶原沉积，并伴有TIMP-1、TNF-α和IL-6表达的增加，这与Nakamura等[10]的研究是一致的，说明百草枯中毒后期出现广泛的肺纤维化。

盐酸氨溴索具有抗炎、抗氧化和促进肺泡表面活性物质释放等作用，能够减轻放射性、内毒素等所致的急性肺损伤[11-12]。本研究主要发现，氨溴索能够减轻百草枯中毒所导致的肺损伤和肺胶原的沉积，同时降低TIMP-1、TNF-α和IL-6的水平，提示氨溴索对于百草枯中毒所致的急性肺损伤及后期的纤维化有一定的保护作用。

TNF-α与肺纤维化和肺间质炎症密切相关，在肺纤维化中起重要作用[13-14]。IL-6具有广泛的生物学功能，在肺纤维化过程中，大量增生的淋巴细胞、巨噬细胞以及成纤维细胞可以产生大量的IL-6，导致IL-6水平的升高[15-17]。本研究发现氨溴索能够降低TNF-α和IL-6的表达，提示氨溴素对百草枯中毒所致的后期肺纤维化的保护作用可能与这两个细胞因子相关。

急性百草枯中毒患者由肺损伤渐进发展为肺间质纤维化，其发生发展与TIMP-1的表达相关，研究结果显示百草枯中毒后导致TIMP-1水平升高，考虑为中毒后肺泡内皮、上皮细胞受损，释放一系列细胞因子和炎性递质，促进基质金属蛋白酶合成与活化，从而参与细胞外基质和基底膜的降解，导致急性肺损伤[18-20]。而中毒后期，TIMP-1仍持续高于正常，此时，TIMP-1的表达占优势，参与肺纤维化的进展[21-22]。本研究发现肺纤维化程度越高，TIMP-1的表达越高，而氨溴索干预后可以明显降低TIMP-1的表达。

综上所述，本研究发现氨溴索能够减缓急性百草枯中毒引起的肺损伤及肺组织纤维化，这种作用与TIMP-1、TNF-α以及IL-6相关。因而，氨溴索对急性百草枯中毒引起的肺损伤及肺纤维化有一定的保护作用，值得进一步研究。

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（收稿日期：2016-11-24 本文编辑：苏 畅）