银杏内酯的亚临界水提取工艺研究

李文东，郑振佳，高乾善，杨 鹏，王 晓*

(1.山东省中药质量控制技术重点实验室 山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；3.济南康森三峰生物工程有限责任公司，山东 济南 250014)



银杏内酯的亚临界水提取工艺研究

李文东1,2，郑振佳1,2，高乾善1，杨 鹏3，王 晓1*

(1.山东省中药质量控制技术重点实验室 山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；3.济南康森三峰生物工程有限责任公司，山东 济南 250014)

为了提高银杏内酯的提取率及提取效率，采用亚临界水提取银杏叶中银杏内酯，通过单因素实验探讨了提取温度、提取时间、提取次数和料液比对银杏叶中银杏内酯提取率的影响。运用正交实验优化提取工艺条件如下：提取温度180 ℃，提取时间30 min，提取3次，料液比1∶25(g∶mL)，在此条件下，银杏内酯提取率为0.4623%。亚临界水提取银杏内酯具有绿色环保、无有机溶剂残留、提取率高等特点。

亚临界水提取；银杏内酯；银杏叶；正交实验

银杏叶为银杏科植物银杏(GinkgobilobaL.)的干燥叶，其提取物(extract ofGingkobilobaleaves，EGB)活性化学成分主要包括两大类：黄酮类及萜类[1]。萜类物质主要有二萜类化合物银杏内酯A、B、C和半萜类化合物白果内酯，它们的结构式如图1所示。银杏内酯A、B、C具有独特的C20结构，它们的区别只是在R1和R2基团上的取代基不同，分子量较大，挥发性较差。银杏内酯A、B、C和白果内酯均是血小板活化因子(PAF) 天然的拮抗剂，减少血小板的凝血作用[2]，对老年血栓患者具有很好的治疗效果，并且对中枢神经具有保护作用[3-5]。PAF是一种内源性磷脂，与许多疾病的产生和发展密切相关[6-8]。银杏内酯合成工艺复杂，难度较大，目前工业生产方法仍以提取法为主。

图1 银杏内酯A、B、C及白果内酯结构式Fig.1 Chemical structures of ginkgolides(ginkgolide A，ginkgolide B，ginkgolide C) and bilobalide

亚临界水在沸点以上可保持液体状态及介电常数减小、极性变小的状态，可以用亚临界水来提取极性较小的银杏内酯，是一种绿色萃取技术[9-13]。此方法可以节约时间，减少有机试剂的污染。作者在此用亚临界水提取银杏叶中银杏内酯，采用单因素实验探讨了提取温度、提取时间、提取次数和料液比对提取效率的影响，运用正交实验优化了提取工艺条件。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

银杏叶，山东双花制药有限公司。

银杏内酯标准品：白果内酯(纯度≥98%)、银杏内酯A(纯度≥98%)、银杏内酯B(纯度≥98%)、银杏内酯C(纯度≥98%)，上海生化试剂厂；水为去离子水；异丙醇为色谱纯。

KT-300Y型超声波药品处理机；Agilent 1260型液相色谱仪、385-ELSD型蒸发光散射检测器，安捷伦科技有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KDM型可控调温电热套，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 银杏内酯标准曲线的绘制

精密称定银杏内酯标准品，加甲醇配制成白果内酯2 mg·mL-1、银杏内酯A 1 mg·ml-1、银杏内酯B 1 mg·mL-1、银杏内酯C 1 mg·mL-1的混合溶液，作为标准溶液。取标准溶液0.1 mL、0.6 mL、1.1 mL、1.6 mL、2.1 mL、3.6 mL分别稀释定容到50 mL容量瓶中，分别取30μL标准溶液注入液相色谱，用蒸发光散射检测器检测。液相色谱条件：流动相为异丙醇-水(10∶90，体积比)，YMC-Pack ODS-A 柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流速为1 mL·min-1，气体流速为1.6 L·min-1，漂移管温度为90 ℃，测定完成后，用外标两点对数法计算，得银杏内酯的提取率。表1为4种银杏内酯标准曲线拟合的线性方程及R2。

表1 4种银杏内酯线性方程及R2

Tab.1 Linear equations of four kinds of ginkgolides andR2

银杏内酯种类线性方程R2白果内酯y=1.360x+7.3790.997银杏内酯Ay=1.307x+7.0730.999银杏内酯By=1.263x+6.9540.998银杏内酯Cy=1.327x+7.2340.999

注：x为进样量(mg)的对数值；y为检测器响应值峰面积的对数值。

1.2.2 银杏内酯的提取及提取率的测定

取样品3.5 g放入不锈钢加热釜内，加水70 mL，密封，升温，当样品升温到设定温度时开始计时。提取完成后冷却到室温，用定性滤纸(型号为102)过滤，回收提取液，浓缩，用甲醇定容到100 mL容量瓶中，室温超声30 min，混匀，静置。取适量样品用针头式微孔过滤器滤过、0.22μm有机滤膜后进高效液相色谱检测。根据标准曲线方程分别计算银杏内酯的质量，银杏内酯提取率(Y)按下式计算：

1.2.3 银杏内酯提取条件的单因素实验

分析亚临界水提取银杏内酯的主要影响因素，选择提取温度、提取时间、提取次数、料液比(g∶mL，下同)进行单因素实验，探讨其对银杏内酯提取率的影响。在预实验中，亚临界水体系压力对提取率影响较小，所以在本次实验中不予考虑。

1.2.4 正交实验

在单因素实验的基础上，选取提取温度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)及料液比(D)作为考察因素，采用L9(34)正交表优化亚临界水提取银杏内酯的工艺条件[14-15]，正交实验的因素及水平见表2。

表2 正交实验的因素及水平

Tab.2Factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对提取率的影响

在前期预实验的基础上设定提取时间为30 min，料液比为1∶20，提取2次，研究提取温度对银杏内酯提取率的影响，结果如图2所示。

图2 提取温度对提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate

由图2可知，提取率随提取温度的升高而增大，但实验发现190 ℃以上时银杏内酯有分解，特别是白果内酯的含量会减少，因此，提取温度过高不利于银杏内酯的提取。

2.1.2 提取时间对提取率的影响

设定料液比为1∶20、提取2次、提取温度为160 ℃，研究提取时间对银杏内酯提取率的影响，结果如图3所示。

由图3可知，提取时间超过30 min后，提取率增加缓慢，由此可知亚临界水能快速高效地使银杏内酯扩散至溶液中。

图3 提取时间对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate

2.1.3 提取次数对提取率的影响

设定料液比为1∶20、提取温度为160 ℃、提取时间为30 min，研究提取次数对银杏内酯提取率的影响，结果见图4。

图4 提取次数对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate

由图4可知，提取次数增加到3次时，提取率增幅趋于平缓，再增加提取次数对提取率影响不大。

2.1.4 料液比对提取率的影响

设定提取温度为160 ℃、提取时间为30 min、提取次数为2次，研究料液比对银杏内酯提取率的影响，结果见图5。

图5 料液比对提取率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

由图5可知，提取率随溶剂的增加而增大，当料液比到1∶20后，提取率增幅趋于平缓。

2.2 正交实验结果与分析(表3)

表 3 正交实验的结果与分析

Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiment

从表 3可看出，各因素对银杏内酯提取率的影响大小顺序为：D>A>C>B，料液比对亚临界水提取工艺的影响最大，然后是提取温度、提取次数、提取时间，由此可以看出亚临界水提取工艺可以快速高效地提取银杏内酯。最佳组合为A3B3C3D3，即提取温度180 ℃、提取时间30 min、提取3次、料液比 1∶25。

2.3 亚临界水提取法与传统的乙醇加热回流法的比较

采用亚临界水提取银杏内酯的最佳条件与传统的乙醇加热回流法(料液比1∶25，提取时间120 min，提取3次，乙醇体积分数70%)进行比较，结果见表4。

表4 两种提取方法对银杏内酯提取率的影响

Tab.4 Effect of two extraction methods on extraction rate of ginkgolides

从表4可以看出：亚临界水提取银杏内酯的提取率为 0.4623%，与乙醇加热回流法提取银杏内酯的提取率(0.4502%)相差不大。但传统的乙醇加热回流法提取银杏内酯，时间长、溶剂用量大、成本高、有机溶剂残留；而亚临界水提取法的时间大大缩短，不需要有机溶剂，可以降低有机溶剂对提取物的污染。由此可见，亚临界水提取银杏内酯比传统乙醇加热回流法省时节能，且效率更高。

3 结论

采用亚临界水提取银杏叶中银杏内酯，通过单因素实验和正交实验得到最佳提取工艺条件为：提取温度180 ℃，料液比 1∶25，提取时间30 min，提取3次。亚临界水提取银杏内酯省时节能、提取效率和提取率高，是一种实用高效的提取方法，可应用于工业化生产。

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Subcritical Water Extraction of Ginkgolides fromGinkgobilobaLeaves

LI Wen-dong1，2，ZHENG Zhen-jia1,2,GAO Qian-shan1，YANG Peng3,WANG Xiao1*

(1.KeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；2.CollegeofFoodScienceandEngineering，ShandongAgriculturalUniversity，Taian271018，China；3.JinanKangsenSanfengBiologicalEngineeringTechnologyCo.，Ltd.,Jinan250014，China)

In order to improve the extraction rate and extraction efficiency of ginkgolide，ginkgolides fromGinkgobilobaleaves were extracted with subcritical water.The effects of extraction temperature，extraction time，extraction times and solid-liquid ratio on the extraction rate of ginkgolides fromGinkgobilobaleaves were investigated by a single factor experiment.The optimal extraction conditions by orthogonal experiment were as follows：extraction temperature of 180 ℃，extraction time of 30 min，extraction times of 3，and solid-liquid ratio of 1∶25 (g∶mL) .Under above conditions，the extraction rate of ginkgolide was 0.4623%.The study shows that subcritical water extraction is green and environmentally-friendly，without organic solvent residue and with high extraction rate.

subcritical water extraction；ginkgolide；Ginkgobilobaleaf；orthogonal experiment

山东省科技发展计划项目(2014GZX219003)

2016-12-19

李文东(1990-)，男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏,E-mail:1169858758@qq.com；通讯作者：王晓，研究员，E-mail：wangx@sdas.org。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.05.007

R284.2

A

1672-5425(2017)05-0033-04

李文东，郑振佳，高乾善，等.银杏内酯的亚临界水提取工艺研究[J].化学与生物工程，2017，34(5)：33-36.