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2,3-二芳基-1,3-苯并噁嗪的合成及对利什曼原虫CYP51活性的初步研究

2017-06-01唐子龙韩新亚李新兴许志峰万义超

关键词:原虫抑制剂光谱

唐子龙, 韩新亚, 李新兴, 许志峰, 万义超

(1.湖南科技大学 理论有机化学与功能分子教育部重点实验室, 湖南 湘潭 411201;2.华中师范大学 化学学院, 武汉 430079; 3.衡阳师范学院 化学与材料科学学院, 湖南 衡阳 421002)

2,3-二芳基-1,3-苯并噁嗪的合成及对利什曼原虫CYP51活性的初步研究

唐子龙1*, 韩新亚2, 李新兴1, 许志峰3, 万义超1

(1.湖南科技大学 理论有机化学与功能分子教育部重点实验室, 湖南 湘潭 411201;2.华中师范大学 化学学院, 武汉 430079; 3.衡阳师范学院 化学与材料科学学院, 湖南 衡阳 421002)

首次对2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1,3-苯并噁嗪(1)与利什曼原虫CYP51的相互作用进行了初步研究,发现化合物1对利什曼原虫CYP51表现出较强的抑制活性,且作用方式类似于底物与利什曼原虫CYP51的I型结合方式.该研究不仅发现了一种新型非唑类针对利什曼原虫CYP51的抑制剂:1,3-苯并噁嗪,而且也为创制新型作用方式的CYP51抑制剂研究提供了依据.

2,3-二芳基-1,3-苯并噁嗪; 利什曼原虫; CYP51; 活性

1,3-苯并噁嗪衍生物是一类重要的含氮杂环化合物,具有抗癌[1-3]、抗血小板聚集[4]、抗细菌和真菌[5-6]、抗结核病[7-8]、杀虫[9]等广泛的生物活性[10-12].本课题组曾报道2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1,3-苯并噁嗪(1)具有良好的抑制水稻纹枯病菌的活性(100%,500 μg/mL)[13],同时对蚜虫也具有一定的活性[14].这里将报道化合物1(见图1)对利什曼原虫(Leishmania infantum)的杀虫活性.文献对1,3-苯并噁嗪类化合物的杀虫活性虽有报道[9,14],但是相对较少,特别是对利什曼原虫的杀虫活性还未见报道.利什曼原虫是引起利什曼病的病原体.利什曼病的临床特征主要表现为长期不规则的发热、脾脏肿大、贫血、消瘦、白细胞减少和血清球蛋白的增加,如不予合适治疗,患者大都在病后1~2 a内因并发其他疾病而死亡.本病多发于地中海国家及热带和亚热带地区,大约危及世界上90多个国家[15],我国主要发生在新疆、甘肃、四川、陕西、山西和内蒙古等地区.至今,利什曼病几乎没有防治的疫苗,只有少量中等治疗效果的药物.CYP51(甾醇14α-去甲基化酶)是生物甾醇合成过程中的关键酶,当其活性和功能受到抑制,就不能有效供给生物甾醇C-14α甲基羟基化所需氧原子,导致C-14α位去甲基化反应受阻,生物甾醇合成减少或被完全阻断,最后导致菌体细胞死亡[16-17].因此,利什曼原虫所含CYP51成了化学药物治疗利什曼病的潜在靶标[15].所以,为了寻找杀利什曼原虫的高活性化合物,获得治疗利什曼病的高效药物,本文研究了化合物1对利什曼原虫CYP51的抑制活性以及二者的作用方式.

图1 化合物1的结构Fig. 1 Structure of compound 1

1实验部分

1.1仪器与试剂

NMR用Bruker Avance II-500 M核磁共振仪测定;红外(IR)用PE-2000型傅里叶变换红外光谱仪测定;熔点用WRS-1B数字熔点仪测定(未校正);元素分析用PE 2400 II元素分析仪测定;质谱使用Thermo Finnigan LCQ质谱仪测定;双光束紫外-可见分光光度计(Perkin Elmer,UV-Lambda35/*);分析天平(Sartorius,BT25S);移液器(eppendorf);分子对接采用Sybyl-X1.3软件.磷酸钾盐缓冲液和所用试剂或溶剂均为分析纯或化学纯.

1.2化合物1的合成[13]

将2-((对甲苯基氨基)甲基)苯酚(1.07 g, 5 mmol)与邻硝基苯甲醛(0.98 g, 6.5 mmol)溶于三氯甲烷与环己烷的混合溶液中 (100 mL,V/V=1/7 )并加入到250 mL圆底三颈烧瓶中,加入含有四氯化锡(0.26 g, 20%mol)的三氯甲烷溶液,安装分水器,通入氮气,加热回流5 h (TLC检测),反应完后,加三乙胺调节体系的pH值等于8,然后加入100 mL乙酸乙酯,分别用水(50 mL×2次)与氯化钠饱和溶液(50 mL×2次) 洗涤有机相,有机相用无水硫酸钠干燥,减压脱溶得黄色油状物,用乙酸乙酯-石油醚重结晶得黄色固体产物,产率80%.m.p. 152.6~153.0 ℃.

1H NMR (CDCl3, 500MHz,δ): 2.25 (s, 3H, CH3), 4.00 (d,J=17.0 Hz, 1H, CH2), 4.19 (d,J=17.0 Hz, 1H, CH2), 6.85 (s, 1H, CH), 6.86~6.89 (m, 1H), 7.00~7.06 (m, 6H), 7.17~7.20 (m, 1H), 7.44~7.47 (m, 2H), 7.61~7.64 (m, 1H), 7.71~7.74 (m, 1H);13C NMR (CDCl3, 125MHz,δ): 20.74, 47.12, 85.52, 116.72, 120.45, 120.86 (2C), 121.13, 124.45, 126.72, 128.41, 128.76, 129.21, 129.80 (2C), 131.84, 132.76, 132.99, 146.74, 149.08, 152.60; IR (KBr, ν): 3 083,3 021,2 972,2 920,1 610,1 585,1 530,1 513,1 486,1 456,1 437,1 386,1 363,1 337,1 292,1 276,1 268,1 224,1 198,1 144,1 109,1 034,1 024,1 015,978,961,935,852,839,820,782,757,736,714 cm-1; MS (ESI): 347 [M+H]+; Anal Calcd for C21H18N2O3: C 72.82; H 5.24; N 8.09. Found: C 73.11; H 5.26; N 8.05.

1.3化合物1与利什曼原虫CYP51结合光谱实验[17]

称取适量质量的化合物1,使用DMSO将其溶解配成0.25 mmol/L,0.5 mmol/L,1 mmol/L,2 mmol/L,5 mmol/L浓度梯度的化合物1储液备用.使用磷酸钾缓冲液将利什曼原虫CYP51稀释到2 μmol/L,并将其分别加入实验组和对照组的石英比色皿中进行基线校准.然后使用移液器,每次加入1 μL适当浓度的化合物1,常温反应3 min后扫描记录光谱吸收,重复上述操作直至随着化合物1的加入吸收光谱没有明显变化为止.结合常数Kd由Ifree(自由化合物浓度)与ΔA(吸光度差值)拟合得到的logistic回归方程求出,[Ifree]=[Itotal]-E×ΔA/ΔAmax;其中,[I]和[E]是滴定体系中的化合物1的浓度和利什曼原虫CYP51的浓度,ΔA是给定化合物浓度下光谱波峰与波谷吸收值之间的差值,ΔAmax是饱和状态下的ΔA.

1.4化合物1与利什曼原虫CYP51分子对接[15]

选择利什曼原虫CYP51的晶体结构(PDB ID: 3L4D)为模板,在Sybyl-X1.3中对其进行加氢处理.使用Sybyl-X1.3构建化合物1并对其进行力场和电荷优化,使用Surflex-Dock模块将化合物1对接到利什曼原虫CYP51的晶体结构中,综合考虑化合物1和利什曼原虫CYP51的结构信息以及对接打分,选择出化合物1与利什曼原虫CYP51可能的结合方式.

2结果与讨论

2.1化合物1与利什曼原虫CYP51结合光谱

[17],以药物酮康唑(CYP51抑制剂)为对照样品,考察了化合物1与利什曼原虫CYP51的结合能力.结合光谱实验表明,随着滴定浓度的增加,化合物1与利什曼原虫CYP51呈现明显的结合,表现在约394 nm处有波峰,430 nm处出现波谷,是细胞色素P450的典型I型结合光谱(图2).可能的原因是化合物1与利什曼原虫CYP51的结合使得卟啉环中的铁原子由原来的6配位变成了5配位的高自旋状态,最高吸收峰蓝移形成I型结合光谱.这种类似于底物与利什曼原虫CYP51的I型结合光谱,既为发现新型作用方式的CYP51抑制剂提供了参考,也将为非唑类CYP51抑制剂的研发提供依据.目前,使用的唑类药物多为CYP51抑制剂,它们与CYP51的结合光谱通常表现为II型结合,而且由于唑类药物的长期使用,已有不少药物产生抗性[18].解决这一问题的方法之一,就是创制具有新型作用方式的CYP51抑制剂或非唑类CYP51抑制剂.

图2 化合物1与利什曼原虫CYP51结合光谱Fig.2 Difference spectra obtained with compound 1 and L. infantum CYP51

为了具体评价化合物1的结合能力,测定了化合物1与利什曼原虫CYP51的结合常数Kd.如图3所示,以反应体系中游离化合物1的浓度为横坐标,以吸光度差值ΔA为纵坐标,拟合得到化合物1与利什曼原虫CYP51的结合常数Kd=7.7±1.4 μM,表明化合物1具有较强的结合能力(酮康唑:Kd=0.05±0.002μM).

图3 化合物1饱和滴定曲线(X轴代表自由化合物1浓度(Ifree),Y轴代表吸光度差值ΔA)Fig.3 Compound 1 binding saturation curve(The X-axis represents the concentration of the unbound compound 1 (Ifree); the Y-axis represents absorbance difference ΔA)

2.2化合物1与利什曼原虫CYP51结合方式

为了探究化合物1与利什曼原虫CYP51可能的结合方式,将化合物1对接到利什曼原虫CYP51的活性空腔内[15],综合考虑打分以及化合物1和利什曼原虫CYP51活性空腔结构信息,选择了如图4所示的化合物1与利什曼原虫CYP51的结合构象.从这个构象中可以看出,利什曼原虫CYP51的活性空腔是较为疏水的,化合物1中带硝基的苯环与V460、L355有疏水相互作用;带甲基的苯环伸向了F109、A286、F104和F289形成的疏水口袋;苯并噁嗪环所含苯基与F289形成π-π相互作用.

图4 化合物1与L. infantum CYP51可能的结合模式图Fig.4 Possible complex of compound 1 and L. infantum CYP51

3结论

合成了2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1,3-苯并噁嗪1.初步研究了化合物1对利什曼原虫CYP51的抑制活性,结果表明化合物1不仅对利什曼原虫CYP51表现出较强的结合能力,且为类似于底物与利什曼原虫CYP51的I型结合方式,因此该研究不仅发现了一种新型非唑类针对利什曼原虫CYP51的抑制剂:1,3-苯并噁嗪,也为发现新型作用方式的CYP51抑制剂研究提供了参考.

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Synthesis of 2,3-diaryl-1,3-benzoxazine and preliminarystudies on its activity againstLeishmaniainfantumCYP51

TANG Zilong1, HAN Xinya2, LI Xinxing1, XU Zhifeng3, WANG Yichao1

(1.Key Laboratory of Theoretical Organic Chemistry and Functional Molecule of Ministry of Education,Hunan University of Science and Technology, Xiangtan, Hunan 411201;2. School of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079;3.School of Chemistry and Material Science, Hengyang Normal University, Hengyang, Hunan 421002)

The interaction of 2-(2-nitrophenyl)-3-(4-methylphenyl)-1,3-benzoxazine (1) andLeishmaniainfantumCYP51 was preliminarily investigated for the first time. The results indicated that compound 1 exhibited relatively strong inhibitory activity with I type mode of action similar to the model between the substrate andLeishmaniainfantumCYP51. The study has not only discovered a new kind of non-azole inhibitor (1,3-benzoxazine) againstLeishmaniainfantumCYP51, but also provided experimental basis for the discovery of new CYP51 inhibitory with new mode of action.

2,3-diaryl-1,3-benzoxazine;Leishmaniainfantum; CYP51; activity

2016-09-28.

国家自然科学基金项目(21372070);国家科技支撑计划项目子课题(2011BAE06B01);理论有机化学与功能分子教育部重点实验室开放基金项目(LKF1402).

1000-1190(2017)01-0052-04

O626

A

*通讯联系人. E-mail: zltang67@aliyun.com.

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