高脂饮食HFA-小鼠肠道菌群结构和NF-κB炎症通路研究

高洁，孙静，黄建，龚凌霄，霍军生*

（1.中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京100050；2.国家卫生计生委微量元素营养重点实验室，北京100050；3.北京工商大学食品学院，北京100048）

高脂饮食HFA-小鼠肠道菌群结构和NF-κB炎症通路研究

高洁1，2，孙静1，2，黄建1，2，龚凌霄3，霍军生1，2*

（1.中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京100050；2.国家卫生计生委微量元素营养重点实验室，北京100050；3.北京工商大学食品学院，北京100048）

通过胖瘦HFA-小鼠模型研究肠道菌群结构在高脂饮食下的变化及宿主炎症反应。实验前后高通量测序结果显示，1组小鼠优势菌相拟杆菌属（Bacteroides）的组成比例由61.9%降低为40.5%；非优势菌相中Akkermansia、Blautia、Dorea、埃希氏菌属（Escherichia）及Turicibacter5个菌属分别增加为原来的70.4、3.9、13.3、4.5和311倍；Alistipes和乳杆菌属（Lactobacillus）2个菌属减少为原来的1/10和1/5；2组小鼠肠道菌群拟杆菌属（Bacteroides）由31.2%增加为39.4%，Parabacteroides由18.9%降低为8.4%。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）结果显示，各组小鼠炎症因子水平无差异（P＞0.05），而第1组的相关调控基因NF-κB和PPARγ的表达量显著高于第2组（P＜0.05）。因此推断，在属水平上，“胖菌群”HFA-小鼠肠道菌群容易受到高脂饮食的改变，“瘦菌群”HFA-小鼠肠道菌群结构相对稳定；肠道菌群可能通过影响PPARγ和NF-κB两个基因的表达而引起炎症反应。

高脂饮食；人源肠道菌群小鼠；炎症因子；基因NF-κB；基因PPARγ

GAO Jie1,2,SUN Jing1,2,HUANG Jian1,2,GONG Lingxiao3,HUO Junsheng1,2*
(1.National Institute for Nutrition and Health,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China; 2.Key Lab of National Health and Family Planning Commission for Microelements Nutrition,Beijing 100050,China; 3.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

肠道菌群的组成和分布与宿主的代谢活动密切相关，不同肠道菌群结构会导致宿主对肥胖及代谢相关疾病的敏感性不同。一项对丹麦人123例非肥胖个体样本和169例肥胖个体样本的研究表明，菌群丰度低的人更容易有肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常以及与炎症相关的一些特征，并且在肥胖个体中间，低菌群丰度个体比高菌群丰度个体更容易发胖[1]。另外一项胖瘦双胞胎菌群的移植实验表明，在健康饮食的情况下，接受了肥胖个体菌群的小鼠体质量和脂肪的增加显著高于接受“瘦菌群”的小鼠；而在同样的高脂饮食情况下，移植了瘦人肠道菌群的小鼠没有发生明显的肥胖[2]。除了膳食和环境的外因，肥胖发生的一个重要内因是肠道菌群结构失调引起的全身慢性炎症反应，敲除了炎症毒素受体CD14的小鼠，不会发生因注射毒素引起的肥胖[3]。在肥胖个体的脂肪或血清中，能够观察到高水平的炎症因子如白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素IL-8（interleukin-8，IL-8），肿瘤坏子因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。

炎症因子的释放受到早期核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的正向调控和氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）的负调控[4-5]。本研究利用不同人源肠道菌群（human flora-associated，HFA）无菌小鼠模型[6-7]，通过测定不同组小鼠肠道菌谱、部分生化指标以及相关炎症因子表达水平的变化，研究高脂饲料模式下“胖菌群”和“瘦菌群”小鼠肠道菌群及NF-κB炎症通路的不同反应，以阐明高脂饮食-肠道菌群-宿主炎症通路代谢水平三者之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人的粪便样本：通过体质量、遗传病、吸烟、饮酒指标的筛选，从6对父子或母女志愿者中选择了一对母女作为粪便样本的提供者。纳入实验的基本标准为一对志愿者应该是父子或母女，二人体质指数（body mass index，BMI）值分别为肥胖和正常，血脂四项和血糖指标正常，没有遗传病或代谢相关疾病，不吸烟、不饮酒。

C57BL/6无菌小鼠（雌性，7～8周龄，体质量17.4～20.0 g）：购于中国医学科学院医学实验动物研究所，饲养环境，无菌隔离器；C57BL/6 SPF小鼠（雌性，7～8周龄，体质量18～22g）：购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

动物饲料：无菌鼠基础饲料，购于中国医学科学院医学实验动物研究所；普通小鼠基础饲料，购于军事医学科学院实验动物中心；无菌高脂饲料，定制于军事医学科学院实验动物中心；高脂饮食配方：78.8%基础饲料中加入10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆酸盐。

总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triacylglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）检测试剂盒：北京利德曼生化股份有限公司；

核糖核酸酶抑制剂（ribonucleoseInhibitor，RI）、禽成髓细胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆转录酶：美国Invitrogen公司；2×PCR mix：德国QIAGEN公司；YAD-D1130小鼠IL-1、YAD-D1026小鼠IL-6、YAD-D1050小鼠IL-8、YAD-D1055小鼠TNF-α酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）检测试剂盒：北京雅安达生物技术有限公司；肠道菌群检测（肠道细菌DNA提取试剂盒）：华大基因。

1.2 仪器与设备

7100全自动生化分析仪：日本日立有限公司；NANO DROP紫外分光光度计、LabsystemsAC8洗板机：美国Thermo有限公司；POWERPAC3000电泳仪、DNASUBCELL水平电泳仪：美国BIO RAD有限公司；GIS-1600凝胶成像系统：上海天能科技有限公司；ABI ViiA 7实时荧光定量PCR系统：美国Applied Biosystems公司；NANO Quant infinite M200PRO多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；DNM-9602酶标仪：北京普朗新技术有限公司；HiSeq 2000 DNA测序仪：美国Illumina有限公司。

1.3 方法

1.3.1 志愿者体检

志愿者自愿参与实验，签订“知情同意书”后进行血液、尿液和粪便的样本的相关体检。检测项目包括：身高、体质量、体脂率、尿常规、便常规、血常规、血脂四项（TC、TG、HDL-C、LDL-C）以及炎症因子水平（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α）。根据检测指标确定志愿者粪便样品是否纳入实验。

1.3.2 不同菌群来源HFA-小鼠模型建立

在志愿者身体状况良好的时候，收集志愿者清晨第1次排出的新鲜粪便，迅速置于无菌厌氧管中，一部分-80℃冷冻保存用于肠道菌群高通量测序，另一部分参考张晓婧等[8]的方法稀释成1%的悬液待用。将C57BL/6无菌小鼠10只按体质量随机分为2组，每组5只。在分组后的第1、3、7天按照2 mL/100 g的量灌胃人肠道菌悬液，第1组灌胃母亲菌群样本，第2组灌胃女儿菌群样本，分别建立不同菌群来源（HFA）-小鼠模型。

1.3.3 动物实验

C57BL/6 SPF小鼠14只作为第3组，小鼠自身肠道菌群对照组与上述两组共同进行动物实验。在无菌鼠肠道菌群定殖完成后，分别取3组小鼠粪便-80℃冷冻保存备用，然后将3组小鼠的饲料统一更换为高脂饲料。实验期间自由进食和饮水，连续喂养6周，每周称质量1次。实验结束后，所有动物禁食12 h，称体质量，取每只小鼠粪便用于肠道菌群检测；小鼠经戊巴比妥钠麻醉[9]后腹主动脉取血，离心取血清用于血脂和炎症因子水平检测；取肝脏、生殖周脂肪称质量，其中脂肪用于NF-κB和PPARγ基因表达水平的检测。上述全部生物样本于-80℃冷冻保存备用。

动物实验已通过中国疾病预防控制中心营养与健康所伦理审查。

1.3.4 肠道菌群高通量测序分析

使用华大基因研发的肠道细菌脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleicacid，DNA）提取试剂盒对志愿者和小鼠的粪便样本进行DNA提取，并使用通用引物515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGGTAA-3′和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）对其16SRDNA的V4区进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。

将扩增产物在Illumina平台进行双末端测序，下机后得到reads数据，去除低质量reads后使用拼接软件FLASH将其拼接为Tags，拼接的Tags经过优化后，在97%相似度下将其聚类为物种分类的分类操作单位（operational taxonomic units，OUT）用于物种注释[10-11]。

1.3.5 炎症因子水平ELISA测定

按照检测试剂盒说明书制备标准品，稀释5个梯度，每个梯度每孔加样量50 μL。分别设置空白孔和待测样品孔，根据说明书加样并进行相应反应。反应终止后，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD450nm）值。以标准物（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α）的质量浓度（x）为纵坐标，OD450nm值（y）为横坐标，绘制各标准物标准曲线，计算出各标准曲线的回归方程（IL-1：y=899.4x-112.17，R2=0.997 7；IL-6：y=45.093x-6.5148，R2=0.9970；IL-8：y=178.81x-20.804，R2=0.996 7；TNF-α，y=446.75x-52.455，R2=0.998 3），按照标准曲线的回归方程计算样品的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α含量。

1.3.6NF-κB和PPARγ基因表达水平实时荧光定量PCR检测

分别提取各个小鼠脂肪样本的总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），参照RNA提取试剂盒的步骤完成，将干燥后的RNA溶解于RNA-free水中，取1 μL测定OD260nm，并定量。

逆转录反应体系为：二乙基焦碳酸酯（diethyl procarbonate，DEPC）处理过的灭菌蒸馏水（8－x）μL，RNA酶抑制剂（50 U/μL）0.5 μL，随机引物（50 pmol/L）2 μL，RNA x μL（2 μg），而总RNA体积与DEPC水的总体积是8 μL。上述离心管于65℃水浴处理5 min，室温放置10 min，高速（＞5 000×g）离心5 s；然后按下列顺序在1.5 mL离心管加入下列反应物（加入之后总体积为20 μL）：RNA酶抑制剂（50 U/μL）0.5 μL，5×buffer 4 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）MIX（10 mmol/L）2μL，二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）2μL，AMV（200 U/μL）1 μL。40℃水浴1 h，90℃处理10 min，冰浴5 min后高速（＞5 000×g）离心5 s。

设计引物（表1）对目的片段进行PCR扩增，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参。PCR反应体系为：H2O 6.6 μL，2× PCR MIX 8 μL，上游引物（50 pmol/L）0.2 μL，下游引物（50 pmol/L）0.2 μL，就是反转录产物1 μL。反应条件为：95℃反应2 min后，94℃10 s，60℃10 s，72℃40 s，反应40个循环。

表1 目的片段引物序列Table 1 Primer sequence of target fragments

1.3.7 结果统计

利用统计分析软件SPSS 16.0处理得到的数据，采用ANOVA进行方差分析，比较P值，P≥0.05为无显著差异，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 志愿者体检结果

体检结果显示，志愿者血、尿、便常规检测均正常，其他指标检测结果见表2，母亲和女儿的腰围、BMI值以及体脂率分别表明其属于肥胖和正常个体。血脂四项指标中，母亲的LDL-C偏高，女儿血脂正常。炎症因子指标显示，二人均有个别炎症因子水平偏高，但无临床症状表现。综合上述体检结果，确定以该组志愿者作为肠道菌群来源。

表2 志愿者体检结果Table 2 Physical examination results of the volunteers

2.2 志愿者及各组小鼠肠道菌谱检测结果

下机数据经过清洗拼接[12]后所得到的OTU进行物种注释分析。志愿者肠道菌群检测中，母亲（H1）的菌群样本得到OTU数量为280，女儿（H2）得到OTU数量为194。小鼠肠道检测中，高脂饲料使用前，1，2，3组得到OTU数量分别为246，284，456；实验结束后，1，2，3组得到OTU数量分别为228，300，469。全部样品共注释到11个细菌门类，分别为放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、厚壁菌门（Firmicutes）、黏胶球形菌门（Lentisphaerae）、变形菌门（Proteobacteria）、互养菌门（Synergistetes）、TM7菌门（细菌域下的一个门）、柔膜菌门（Tenericutes）和疣微菌门（Verrucomicrobia），H1样本中检测到6个门，H2中检测到8个门，志愿者及各组小鼠菌相组成如图1所示。

厚壁菌门与拟杆菌门的比值可作为判定肥胖潜在可能的依据[13-15]，且肥胖个体的肠道菌群更容易受到饮食的影响而发生变化，而纤瘦个体肠道菌群相对稳定，不容易随着饮食的改变而改变[16]。本实验中1、2、3组小鼠实验前后该比值分别为23.3%、61.0%和41.3%及45.6、75.0和55.9，可知第1组实验前后相差最大。也就是说在高脂饲料喂养模式下，来自母亲肠道的菌群结构更容易发生变化，而来自女儿的肠道菌群结构相对稳定，与已有研究结果一致。

图1 志愿者和小鼠肠道菌群在门水平上的注释结果Fig.1 Taxonomic composition distribution in samples of Phylum-level

各个粪便样本在属水平的分类注释如图1所示。由图1可知，使用高脂饲料前，人源肠道菌群的组成和比例在无菌鼠体内定殖的过程中发生了变化，如H1中的毛螺菌属在1组小鼠内定殖后未检测到，1组小鼠中检测到了H1中没有的Bilophila菌属；H2到第2组的定殖过程，肠道菌群也有差异，可能是菌群所处人和鼠的不同肠道代谢环境导致了这一变化。而高脂饲料使用前后，普通小鼠肠道菌群与人源HFA-小鼠肠道菌群都表现出较大差异。

实验前后肠道菌谱比较结果见图2，由整体菌群结构可知1、3组小鼠肠道菌群受到饮食影响较大。两组中优势菌相拟杆菌属（Bacteroides）的组成比例分别由61.9%降低为40.5%，由2.0%增加为7.1%；非优势菌相中，1组中的Akkermansia、Blautia、Dorea、埃希氏菌属（Escherichia）和Turicibacter5个菌属分别增加为原来的70.4倍、3.9倍、13.3倍、4.5倍和311倍，Alistipes和乳杆菌属（Lactobacillus）2个菌属减少为原来的1/5和1/10；3组中的Alistipes、埃希氏菌属（Escherichia），乳杆菌属（Lactobacillus），萨特氏菌属（Sutterella）和Turicibacter5个菌属分别增加为原来的6.8倍，4.8倍，3.1倍，3.3倍和5.9倍，Akkermansia和葡萄球菌属（Staphylococcus）2个菌属减少为原来的1/5和1/10。在ARSLAN M等[16]的研究中发现，低丰度肠道菌群有着巨大的被膳食干预的潜能，而低丰度菌群的宿主特征往往与肥胖相关，与本研究结果一致：胖菌群更容易被高脂饮食影响。高脂饲料喂养前后，第2组小鼠肠道菌群组成变化最小，实验后拟杆菌属（Bacteroides）由31.2%增加为39.4%，Parabacteroides属由18.9%降低为8.4%；另有一些组成比例很小的菌属数量有所下降，如粪球菌属（Coprococcus），Paraprevotella属等。由图2的菌群结构图可知，高脂模式下H2肠道菌群结构相对稳定。

图2 志愿者和小鼠肠道菌群在属水平上的注释结果Fig.2 Taxonomic composition distribution in samples of Genus-level

2.3 实验动物生理生化指标检测结果

实验前后各组小鼠体质量，实验后小鼠肝脏、生殖周脂肪质量，血脂四项指标以及炎症因子水平结果见表3。

表3 各组小鼠生理生化指标测定结果Table 3 Determined results of physiological and biochemical indexes in different groups

由表3可知，实验前后，各组小鼠的上述指标除生殖周脂肪外，均无显著差异。第2组小鼠生殖周脂肪质量显著低于1、3组（P＜0.05），生殖周脂肪能够在一定程度上表示个体肥胖的趋势，本实验结果表明，定殖了“瘦菌群”的HFA-小鼠肥胖的趋势最小。各组小鼠血脂四项和炎症因子指标在实验前后均未表现出差异，接下来对其调控基因做进一步分析。

2.4PPARγ和NF-κBmRNA相对表达量测定结果

实时荧光定量PCR结果见图3。由图3可知，1组小鼠PPARγ和NF-κBmRNA相对表达量显著高于2组。NF-κB因子的活化使炎症因子释放增多[17]，而PPARγ可通过与NF-κB间蛋白-蛋白相互作用，阻止NF-κB与炎症因子基因启动子区的同源顺式元件结合，抑制炎症反应[18]。肥胖状态下，巨噬细胞释放炎症因子，如IL-1、TNF-α等，引起炎症的级联反应。本实验中，虽然各组炎症因子水平未检测到差异，但其调控基因已经在不同组的小鼠中出现了不同的表达水平。根据“胖菌群”HFA-小鼠中两个基因表达水平的上调推断该组小鼠体内具有炎症反应的趋势，血液中炎症水平未检测到升高，可能是由于高表达水平的PPARγ暂时抑制了更高水平的炎症反应。因而，可以进一步推断在高脂模式下，“胖菌群”小鼠发生炎症反应以及肥胖的风险高于“瘦菌群”小鼠，而肠道菌群可能是引起基因表达水平变化，进而引起炎症反应的原因。

图3PPARγ和NF-κB mRNA相对表达量Fig.3 Relative abundance ofPPARγandNF-κBmRNA

3 结论

不同人源肠道菌群定殖到无菌鼠肠道后，与普通小鼠原有菌群存在显著差异，在饲养过程中，能够在无菌小鼠体内保持原有的组成结构特征。与“瘦菌群”HFA-小鼠相比，“胖菌群”HFA-小鼠在高脂饲料模式下，肠道菌群的组成和比例变化更加明显，菌群结构组成不稳定。“胖菌群”小鼠在高脂饲料喂养后，血脂和炎症因子水平未表现出异常，但PPARγ和NF-κBmRNA相对表达量上调，表明了该组小鼠具有炎症和肥胖发生的趋势。推测肠道菌群能够通过影响PPARγ和NF-κB两个基因的表达而引起炎症反应，有待于进一步研究证实。

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R589.2

0254-5071（2017）05-0141-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.030

2017-02-24

科技部-国家重点研发计划课题（2016YFD0400602）

高洁（1983-），女，助理研究员，博士，研究方向为益生菌，肠道微生态。

*通讯作者：霍军生（1962-），男，研究员，博士，研究方向为食品生物技术，强化食品。