序批式固定化菌液态发酵白酒工艺的研究

2017-06-01田梁赵华郑雅元刘阳

中国酿造 2017年5期

关键词：己酸生香总酸

田梁，赵华*，郑雅元，刘阳

（天津科技大学生物工程学院，天津300457）

序批式固定化菌液态发酵白酒工艺的研究

田梁，赵华*，郑雅元，刘阳

（天津科技大学生物工程学院，天津300457）

以高粱糖化液为原料，采用序批式固定化菌液态发酵白酒工艺，酒精发酵最佳时间为36 h。以总酸、总酯含量为评价指标，利用均匀设计试验方法，确定该工艺中固定化生香酵母、乳酸菌、己酸菌的最佳添加量。结果表明，得到液态发酵白酒的固定化菌株最佳添加量为生香酵母5.5%、乳酸菌1.0%、己酸菌3%，在此最优条件下，总酸和总酯含量分别为486.62 mg/L和258.28 mg/L，且所酿白酒中酯类物质和高级醇含量均符合液态法白酒的国家标准。该工艺缩短了酒精发酵时间，并且提高了白酒品质。

均匀设计；固定化菌；液态发酵；白酒工艺；菌种配比

TIAN Liang,ZHAO Hua*,ZHENG Yayuan,LIU Yang
(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

uniform design;immobilized microbe;liquid fermentation;Baijiuprocess;ratio of strains

传统白酒生产大多采用固态发酵，其为手工操作，劳动强度大，且生产过程受气候、环境等自然因素的影响较大，生产效率不高[1]。液态发酵白酒可实现白酒生产机械化操作，具有出酒率高、不用辅料、可供利用的原料品种多、生产效率高等优点[2]，同时液态白酒也存在高级醇含量高而酯类含量不足的缺点。固定化技术是利用物理或者化学的方法，将游离的微生物细胞或酶定位在设定的空间区域内并维持其原有生物活性，使之成为连续流动的生物反应器且可被反复使用的一种生物技术。近年来，在对黄酒、啤酒、葡萄酒的研究中发现，固定化菌可以降低黄酒高级醇的含量、大幅度缩减啤酒发酵时间、提高葡萄酒的风味[3-5]。而在白酒中应用固定化菌的研究较少。

序批式固定化菌液态发酵白酒工艺，是以高粱糖化液为原料，先进行酒精发酵，然后利用固定化生香菌进行二次发酵。本试验通过对发酵过程中总酸、总酯含量的检测，利用均匀设计试验方法优化固定化生香菌的最佳添加量，旨在为新型液态发酵白酒工艺提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

生香酵母、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、己酸菌：实验室保藏菌种。1.1.2试剂

高粱：市售；糖化酶（10万U/g）、耐高温α-淀粉酶（酶活2000U/g）：诺维信生物有限公司；1%酚酞指示液、0.1mol/L NaOH标准溶液：天津市化学试剂五厂；0.1 mol/L硫酸标准溶液：天津市北方天医化学试剂厂；海藻酸钠、氯化钙（纯度98%）：天津市化学试剂一厂。

1.1.3 培养基

酵母培养基[6]：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.02%、NH4Cl 0.2%、pH自然。

乳酸菌培养基[6]：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

己酸菌培养基[7]：体积分数95%乙醇溶液2%（灭菌后加入），NaAc 0.5%，酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.02%，（NH4）2SO40.05%，CaCO30.05%（干热灭菌后加入），pH自然。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890B气相色谱（gas chromatography，GC）仪：美国安捷伦科技有限公司；HH-B11-420型电热恒温培养箱：天津市实验仪器厂；HH-4可调型恒温水浴锅：天津市中环实验电炉有限公司。

1.3 方法

1.3.1 序批式固定化菌液态发酵白酒工艺流程

操作要点：

（1）原料粉碎：取优质高粱粉碎，过40目筛，加入3倍质量的水，打浆。

（2）液化：加入耐高温α-淀粉酶5U/g，90℃液化60min，即得液化液。

（2）糖化：将液化液冷却至室温后，加入糖化酶80 U/g，在60℃条件下保温糖化90 min，冷却至30℃后过滤取上清液，即为糖化液。

（4）酒精发酵：在糖化液中接入1‰的酿酒酵母，30℃发酵36 h。

（5）固定化菌株二次发酵：在酒精发酵完成后的发酵液中加入固定化菌株，控制温度30℃发酵5 d。

（6）蒸馏：蒸馏至酒精度为60%vol。

1.3.2 发酵时间对酒精发酵的影响

在高粱糖化液中接入1‰的酿酒酵母，于30℃条件下进行酒精发酵，在酒精发酵期间每隔4 h取样测其酒精度，考察发酵时间对酒精发酵的影响，确定酒精发酵阶段的最佳发酵时间。

1.3.3 固定化菌制备

在装液量为100 mL/500 mL的酵母培养基中接入5‰生香酵母，30℃培养24 h；在装液量为100 mL/250 mL的乳酸菌培养基中接入一环乳酸菌，30℃培养5 d；在装液量为100 mL/250 mL的己酸菌培养基中接入一环己酸菌，35℃培养7 d[8-10]。

将上述菌液加入至一定量的2%海藻酸钠中，混匀后，用注射器滴加至0.05 mol/L氯化钙溶液中制成海藻酸钠凝胶，于4℃下静置过夜备用[11]，制成固定化菌。

1.3.4 检测方法

酒精度及总酸、总酯含量的测定：参考GB/T 20821—2007《液态法白酒》中的方法。

风味物质成分的测定：采用气相色谱法[12]。色谱条件：色谱柱：LZP-930（50 m×0.32 μm×1.00 mm）；载气：氮气；分流比：10∶1；流速：1 mL/min；进样量：1 μL；进样口温度：200℃；检测器温度：200℃；升温程序：初始温度50℃，保持8 min后以5℃/min升温至150℃，保持15 min；尾吹气：50 mL/min；空气流速：30 mL/min；氢气流速：300 mL/min。

1.3.5 均匀试验设计

根据单因素试验结果，以总酸、总酯含量为评价指标，采用[U7（74）]均匀设计表[13]对固定化菌株生香酵母（X1）、乳酸菌（X2）、己酸菌（X3）的添加量进行优化，均匀试验设计因素与水平如表1所示。

表1 固定化菌添加量优化均匀试验因素与水平Table1 Factors and levels of uniform experiments for immobilized microbes addition optimization

2 结果与分析

2.1 发酵时间对酒精发酵的影响

在高粱糖化液中接入1‰的酿酒酵母，于30℃条件下进行酒精发酵，考察发酵时间对酒精发酵的影响，结果如图1所示。

图1 发酵时间对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of fermentation time on alcohol fermentation

由图1可知，随着发酵时间的延长，发酵液中酒精度呈先增加后趋于平缓。当发酵至36 h时发酵液中酒精度为12.0%vol，继续延长发酵时间，发酵液中酒精度增加不明显，可能是由于发酵液中酵母菌可利用的营养物质减少，乙醇产量逐渐减低。因此选择酒精发酵时间36 h为宜。通常以高粱为原料的酒精发酵时间为48 h[14]，与之相比该工艺缩短了酒精发酵时间。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 生香酵母添加量对总酸总酯变化的影响

在酒精发酵结束后，加入固定化乳酸菌4%、己酸菌4%及一定量的生香酵母（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%），于30℃培养5 d后测定总酸、总酯含量，考察生香酵母添加量对总酸和总酯含量的影响，结果如图2所示。

图2 生香酵母添加量对总酸和总酯含量的影响Fig.2 Effect of aroma-producing yeast addition on the contents of total acid and total ester

由图2可知，随着生香酵母添加量的增加，总酸总酯的含量呈先增加后下降的趋势。当生香酵母添加量为6%时，总酸和总酯含量达到最大值，分别为435.6mg/L和231.0mg/L；增加生香酵母添加量，总酸和总酯含量开始下降，因此，选择固定化生香酵母最佳添加量6%为宜。

2.2.2 己酸菌添加量对总酸总酯变化的影响

在酒精发酵结束后，加入固定化的乳酸菌4%、生香酵母6%及一定量的己酸菌（1%、2%、3%、4%、5%、6%），于30℃培养5 d后测定总酸总酯含量，考察生香酵母添加量对总酸和总酯含量的影响，结果如图3所示。

图3 己酸菌添加量对总酸和总酯含量的影响Fig.3 Effect of caproic acid bacteria addition on the contents of total acid and total ester

由图3可知，随着己酸菌添加量的增加，总酸和总酯含量呈先增加后趋于平缓，当己酸菌添加量为3%时，总酸和总酯含量达到最大值，分别为447.2 mg/L和435.6 mg/L；增加生香酵母添加量，总酸和总酯含量变化不明显。因此，选择固定化己酸菌最佳添加量3%为宜。

2.2.3 乳酸菌添加量对总酸总酯变化的影响

在酒精发酵结束后，加入固定化的生香酵母6%、己酸菌3%及一定量的乳酸菌（1%、2%、3%、4%、5%、6%），于30℃培养5 d后测定总酸总酯含量，考察乳酸菌添加量对总酸和总酯含量的影响，结果如图4所示。

图4 乳酸菌添加量对总酸和总酯含量的影响Fig.4 Effect of lactic acid bacteria addition on the contents of total acid and total ester

由图4可知，随着乳酸菌添加量的增加，总酸含量呈先增加后下降，总酯含量呈先增加后趋于平缓，当生乳酸菌添加量为3%时，总酸和总酯含量达到最大值，分别为450.5 mg/L和235.7mg/L；增加生香酵母添加量，总酸含量开始下降，而总酯含量变化不明显。因此，选择固定化乳酸菌最佳添加量3%为宜。

2.3 均匀试验结果

在单因素试验结果的基础上，对固定化菌种生香酵母（X1）、乳酸菌（X2）、己酸菌（X3）的添加量进行均匀优化试验，均匀试验设计及结果见表2。采用DPS数据处理软件对各因素及交互作用项逐步进行回归分析[15]，结果如表3所示。

表2 固定化菌添加量优化均匀试验设计与结果Table 2 Design and results of uniform experiments of immobilized microbes addition optimization

表3 均匀试验的逐步分析结果Table 3 Results of stepwise analysis of uniform experiments

Y1、Y2回归模型优化拟合方程如下：

由表3可知，总酯含量与固定化菌添加量拟合回归方程相关系数R=0.999 99，调整后的相关系数Ra=0.999 9，总体显著性检验值F=10 255.442 6，显著水平P=0.007 5，剩余标准差（surplus standard deviation，SSE）为0.660 3，因此该方程的可信度高。对回归方程用非线性规划方法进行优化，可以得出菌种添加量最优配比X1=5.58，X2=0.98，X3=3.0，结合实际生产将其代入上述回归方程，得到总酯含量最大预测值为490 mg/L。

总酯含量与固定化菌添加量拟合回归方程相关系数R=0.999 957，调整后的相关系数Ra=0.999 74，总体显著性检验值F=2319.7267，显著水平P=0.0152，剩余标准差（SSE）为0.576 6，因此该方程的可信度高。可以得出菌种添加量最优配比X1=5.71，X2=1.00，X3=2.87，结合总酯优化条件，选择X1=5.5，X2=1.0，X3=3.0将其代入上述回归方程，得到Y2（总酸含量）最大预测值为258.34 mg/L。

2.4 验证试验

采用经优化后的固定化菌添加量进行发酵，即生香酵母5.5%、乳酸菌1.0%、己酸菌3%，验证试验重复3次，测得发酵液中总酯和总酸含量平均值分别为486.62 mg/L和258.28 mg/L，均与模型预测值相差不大。

2.5 酒质的分析

在优化后的发酵时间和最佳固定化菌添加量的条件下，进行序批式固定化菌液态发酵，蒸馏到酒精度为60.0%vol，采用气相色谱法对所酿造白酒中主要风味成分进行检测，检测结果见表4。

由表4可知，酒液中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量达到2.05 g/L和0.67 g/L，而且含有4种高级醇正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇，其含量分别为0.37 g/L、0.62 g/L、0.87 g/L、0.26g/L，其酯类物质和高级醇含量均达到国标GB/T20821—2007《液态法白酒》的要求[16]。结果表明，序批式固定化菌液态发酵白酒工艺可以提高液体发酵白酒品质。

表4 白酒风味成分气相色谱检测结果Table 4 Detection results of flavor compound analysis by gas chromatography

3 结论

本研究采用均匀试验设计，对序批式固定化菌液态发酵白酒工艺中酒精发酵时间及固定化菌种添加量进行了优化。结果表明，酒精发酵时间为36 h，固定化菌最佳添加量为生香酵母5.5%、乳酸菌1.0%、己酸菌3.0%，在此最佳条件下发酵，总酸和总酯含量分别为486.62mg/L和258.28mg/L。蒸馏到酒精度为60.0%vol时，酒液中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量达到2.05 g/L和0.67 g/L，正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇，其含量分别为0.37 g/L、0.62 g/L、0.87 g/L、0.26 g/L，其酯类物质和高级醇含量均达到液态法白酒国家标准，序批式固定化菌液态发酵白酒工艺提高了液体发酵白酒品质，为序批式固定化菌液态发酵白酒提供了理论依据。

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