HPLC法测定清热颗粒中芦丁的含量

张丽云 张建云.广西柳州市中医院，广西 柳州 54500；.广西金嗓子药业股份有限公司，广西 来宾 54600

HPLC法测定清热颗粒中芦丁的含量

张丽云1张建云2
1.广西柳州市中医院，广西 柳州 545001；2.广西金嗓子药业股份有限公司，广西 来宾 546200

目的：研究清热颗粒中芦丁含量和测定方法。方法：采用 HPLC 法分别对6个批次的样品中芦丁含量进行测定。色谱法条件为ZORBAX SB-C18柱(200mm×4.6mm,5μm)，以甲醇-0.5%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,检测波长为 358nm，柱温为 30℃。结果：芦丁进样量在0.206～2.06μg范围内与峰面积呈线性关系,平均回收率为99.86%，r=0.9994，RSD为1.17%(n=6)。结论：HPLC法简便、可靠、准确，可用于清热颗粒的质量控制。

清热颗粒; 芦丁; 含量测定

清热颗粒为广西柳州市中医院院内制剂(批准文号为桂药制字Z02060094)，由桑叶、野菊花、紫花地丁、九里明、蒲公英、岗梅根六味药组方，具有清热解毒、抗菌消炎、清肝明目、疏风散热的功效，用于感冒发热、目赤头痛、上呼吸道感染，咽喉肿痛及各种疥疮，临床疗效显著。桑叶为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花[1]。其含有黄酮类、生物碱类、苯丙素类、有机酸类、甾体及三萜类等多种化合物[2]。桑叶为方中君药，芦丁是其主要化学成分。为了更好的控制制剂的质量，保证其疗效，研究用高效液相色谱法测定清热颗粒中芦丁的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；XS205Du分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-S恒温水浴锅(江苏金坛医疗仪器厂)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料 芦丁对照品(批号：100080-201408，含量90.2%，中国药品生物制品检定所)；清热颗粒(批号：20160725、20160801、20160912、20161025、20161125、20161201，本院自制)；甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)；磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称定芦丁对照品25.75mg于25mL容量瓶中，加甲醇溶解制成1.03 mg/mL的溶液，摇匀，精密量取1mL，移至10mL的容量瓶中，加甲醇溶解制成浓度为0.103mg/mL的对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的配制 取10袋清热颗粒内容物，研细，混匀取约2g，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇50mL，加热回流30min，滤过，滤渣再用甲醇50mL，同法提取2次，合并滤液。减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照品溶液的制备 以相同的处方比例取除桑叶外的药材，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(200mm×4.6mm,5μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.5%的磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：1mL/min；检测波长：358nm；柱温：30℃。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 取0.103mg/mL芦丁对照品溶液分别进样 2、5、7.5、10、12.5、20μL测定峰面积。以峰面积为纵坐标，质量为横坐标绘制标准曲线，得芦丁回归方程:Y=2.0E+9X-1.3E+5，r=0.9994。结果芦丁在0.206～2.06μg范围内线性关系良好。

表1 梯度洗脱条件

2.3.2 精密度实验 取0.103mg/mL 的芦丁对照品溶液分别进样 6次，每次20μL，以芦丁峰面积为指标计算精密度，得RSD=1.17%，表明精密度良好。

2.3.3 稳定性实验 取样品2g，按“2.1.2”项下提取得供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10h进样。以芦丁的峰面积为指标计算稳定性，RSD=1.08%，表明供试品溶液中芦丁在 10h内稳定性良好。

2.3.4 重复性实验 取样品 2g，按“2.1.2”项下提取得供试品溶液，分别进样6针，每针20μL，以芦丁的峰面积为指标计算重复性，RSD=0.92%，表明重复性良好。

2.3.5 专属性实验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20μL进样测定。结果供试品溶液中在与对照品溶液相同位置上具有同一保留时间的色谱峰，而阴性对照品溶液对测定无干扰。见图1。

2.3.6 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品约1g，共6份，每份分别精密加入浓度为0.103mg/mL芦丁对照品溶液各0.6mL，按2015版《中华人民共和国药典》方法操作[1]。以芦丁峰面积为指标计算加样回收率。加样回收率平均100.97%,RSD=0.79%，表明加样回收率良好。

表2 芦丁加样回收率结果

2.4 样品测定 精密称取6个批号的样品各适量，按供试品制备方法制备样品溶液，在色谱条件下测定，用外标法计算芦丁的含量。结果批号为20160725、20160801、20160912、20161025、20161125、20161201的样品中芦丁的含量分别为0.130mg/袋，0.152mg/袋，0.175mg/袋，0.128mg/袋，0.142mg/袋，0.126mg/袋，平均为0.142mg/袋。

3 讨论

将芦丁对照品的甲醇溶液在200nm～600nm 的范围内进行扫描，芦丁在215nm、258nm、358nm 处出现 3 个吸收峰，考虑到在短波长位置，处方中其它的组分干扰太大，结合文献报道[1,3-4]，选择358nm作为检测波长。

研究还对含量测定中流动相的条件进行了考察，曾采用甲醇-水(40∶60)，甲醇-1%冰醋酸溶液(35∶65)及 甲醇-0.5%磷酸溶液(35∶65)作为测定条件，但峰出现拖尾。选用流动相为甲醇-0.5%磷酸溶液进行梯度洗脱[1]，分离效果好，分离度大于1.5，理论塔板数大于3000，且阴性无干扰，故选择本系统为流动相。

在提取溶剂的选择上，采用甲醇、乙醇、水作为提取溶剂，通过比较单一溶剂和混合溶剂，最后选定甲醇溶液作为最佳提取溶剂。考察了加热回流提取时间的影响，结果发现加热回流处理20、30、40min 差别不大，为了提取完全同时又节约时间，故选择加热回流提取30min为宜。

综上，采用HPLC法测定清热颗粒中芦丁的含量，该方法简便、可靠、准确，可用于清热颗粒的质量控制。

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015:297.

[2]王晓静，王元书，邱进，等.桑叶化学成分研究 [J].食品与药品，2007 (1) ：9.

[3]曾森，刘虹，张德芹，等.对市售桑叶药材中芦丁的含量调查[J].中医药导报，2010，16(4)：77-78.

[4]郭玉，唐国涛，陈淑娴，等．槐花米中芦丁提取方法的比较研究[J].中成药，2007，29(11):1675-1677.

Determination of Rutin Content in Qingre Granules by High Performance Liquid Chromatographic

ZHANG Liyun1ZHANG Jianyun2

1.Liuzhou City Hospital, Liuzhou 545001, China；2.Guangxi Golden Melody Pharmaceutical Company Limited, Laibin 546200, China

Objective To establish the method for determining rutin content in Qingre granules. Methods The rutin content was determined respectively by HPLC method in 6 batches of samples. With a ZORBAX SB-C18 column (200mm × 4.6mm,5μm),methanol-0.5% Phosphoric acid solution was used as the mobile phase for gradient elution.The detective wavelength was 358 nm and the column temperature was 30℃.Results The calibration curves of rutin showed that the linearity was completely acceptable between 0.206～2.06μg,The average recovery of rutin was 99.86%(r=0.9994),withRSDof 1.17% (n=6). Conclusion The HPLC method was simple, reliable, accurate and can be used for quality control of Qingre granules.

Qingre granules; Rutin; Content Determination

张丽云(1972-)，女，汉族，主管药师，研究方向为医院药学。E-mail：2672451016@qq.com

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1007-8517(2017)06-0029-02

2017-01-24 编辑：穆丽华)