MTT法与CCK-8法检测兔视网膜色素上皮细胞活性的比较研究

杨冬萍 杨晓旭 俞 洋,2* .宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏 银川 740004

实验研究

MTT法与CCK-8法检测兔视网膜色素上皮细胞活性的比较研究

杨冬萍1杨晓旭1俞 洋1,2*
1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏 银川 740004

目的：探讨MTT法和CCK-8法对细胞活性检测的最佳实验条件，并比较二者的优缺点。方法：取传至第5代的兔视网膜色素上皮细胞为研究对象，分别用MTT试剂和CCK-8试剂检测兔视网膜色素上皮细胞的增殖情况。结果：MTT法最佳检测波长为570nm，最佳检测时间在加入试剂后4h，细胞数量在1.25×103～2×104之间检测较好；CCK-8法最佳检测波长在450nm，最佳检测时间在加入试剂4～6h，适宜的细胞检测范围为1.25×103～1×104。结论：MTT法较CCK-8法细胞检测范围更广，孵育时间更短，是一种优于CCK-8法的细胞活性检测方法。

MTT；CCK-8；兔视网膜色素上皮细胞；细胞活性

检测细胞活性与增殖的方法有很多，如乳酸脱氢酶释放法、台盼蓝拒染法、集落形成法、流式细胞仪法、荧光染色法、MTT比色法等，其中，MTT比色法自1983年Mosmann建立以来，由于其简便、快速、经济等优点，现已广泛用于细胞实验，成为定量检测细胞生长和增殖的理想方法[1]。但由于MTT生成的产物Formazan为非水溶性的，需要有机溶剂(DMSO、异丁醇等)才能溶解，且在吸出培养液时可能会因操作不当，丢失部分Formazan，导致结果可重复性差。针对MTT法的不足，研究发现了很多水溶性的四氮唑蓝类：如XTT法[2]、MTS法[3]、Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)法[4]等。本文以兔视网膜色素上皮细胞为研究对象，探讨MTT法和CCK-8法对细胞活性检测的最佳实验条件，并对二者的优缺点做一比较。

1 仪器与材料

1.1 仪器 E680酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司)。

1.2 材料 MTT试剂(南京凯基批号：2016114)；CCK-8试剂(日本同仁化学，货号：CK04)；DMSO(Aladdin，CAs Number:67-68-5)；第5代兔视网膜色素上皮细胞。

2 方法

2.1 最佳检测波长和最佳孵育时间的确定 取对数生长期的兔视网膜色素上皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化约3min，计数，以每孔细胞密度5×103个，接种于96孔板内，每孔100μL的细胞悬液，每组设4个复孔，96孔板四周用PBS填充，以避免孔内液体蒸发，放入37℃培养箱培养24h使细胞贴壁。CCK-8组每孔加入10μL CCK-8试剂，放入培养箱孵育1、2、3、4、6h后，用酶联免疫检测仪检测各孔不同波长下的OD值；MTT组每孔加入50μL的MTT试剂，放入培养箱孵育1、2、3、4、6h后，吸出上清液，每孔加150μL的DMSO，避光摇床放置10min，用酶标仪检测各孔不同波长下的OD值。酶标仪的内置检测波长均为405、450、490、570、590nm。

2.2 细胞数量与吸光度的关系 将对数生长期的兔视网膜色素上皮细胞，以0.25%胰蛋白酶消化约3min，低速离心，计数，调整细胞密度，使每组细胞密度从高到低依次稀释成2×104、1×104、5×103、2.5×103、1.25×103、6.3×102、3.1×102个/孔，接种于96孔板内，每个浓度组设6个复孔，放入37℃培养箱培养24h，待细胞贴壁后，分别加入10μL CCK-8试剂和50μL MTT试剂，在酶标仪上测量其OD值。

3 结果

3.1 最佳检测波长的确定 如图1、2所示，在检测兔视网膜色素上皮细胞活性时，MTT法和CCK-8法在不同的检测波长条件下，OD值均变化明显。其中MTT法在570nm波长处时，吸光峰值最高且最敏感；CCK-8法在波长450nm处时，吸光峰值最精准。因此，实验中MTT法的最佳检测波长应选570nm处，CCK-8法的最佳检测波长选择450nm处。

3.2 最佳检测时间的确定 如图1、2所示，MTT法在1～4h孵育时间内，表现为随着反应时间的延长，OD值越来越高，呈上升趋势，在4h时间点OD值达到最大，4～6h时段有下降趋势；CCK-8法显示：在1～6h不同孵育时间段内，其OD值与培养时间表现为正相关关系。因此，在检测兔视网膜色素上皮细胞活性时，MTT法的最佳检测时间应选择在加入试剂孵育后的4h，CCK-8法的最佳检测时间在加入试剂孵育后4～6h时间段都是可以的。

3.3 细胞数量与吸光度OD值的关系 由图3可知，当兔视网膜色素上皮细胞数在3.1×102～2×104时，MTT法和CCK-8法均表现为随着细胞数量的增多，OD值呈上升趋势。其中MTT法细胞数在1.25×103～2×104之间时表现为良好的线性关系，CCK-8法适宜的细胞检测范围是1.25×103～1×104。

4 讨论

MTT法原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，将MTT[3-(4,5Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，简称噻唑蓝]还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，而死细胞此酶消失，MTT不被还原。由于Formazan的生成量与活细胞数量及代谢活性有关，测定一定波长下光密度值(OD)的大小，可定量地反映活细胞数量及其活性的改变。研究表明，在一定的细胞浓度范围内，光密度值的大小与活细胞的数量成正比[5]。CCK-8法的实验原理与常规MTT法略有差异，CCK-8试剂中含有WST-8(水溶性四唑盐)，其在电子载体(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸二甲酯)存在的情况下，可被活细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成水溶性的橙黄色结晶，无需使用裂解液，也不需要吸弃培养液，可直接进行比色。

实验探讨了MTT法和CCK-8法检测兔视网膜色素上皮细胞活性的最佳实验条件，结果表明：MTT法最佳检测波长为570nm处，最佳孵育时间为4h，结果与前人研究[6]相似，且不受细胞株的影响，合适的细胞检测数量为1.25×103～2×104；CCK-8法最佳检测波长为450nm处，最佳孵育时间为4～6h，适宜的细胞检测范围在1.25×103～1×104之间，当细胞数量少于1.25×103或高于1×104时，检测结果均较差。说明MTT法和CCK-8法在检测兔视网膜色素上皮细胞活性时，MTT法较CCK-8法细胞检测范围更广，孵育时间更短，实验结果更为稳定。

近年来，Cell Counting kit-8试剂由于其生成产物具有高度水溶性，无需裂解液裂解沉淀，同时也不需要吸出培养液，对贴壁和悬浮细胞均适用，且检测后的细胞可重复利用[7]，具有操作简便、快速、灵敏度高等优点，普遍受到人们的青睐。但缺点是CCK-8试剂价格较为昂贵，且试剂颜色为淡红色，与含有酚红的培养液颜色极其相似，加入试剂之后不会立即显色，因此很容易造成漏加或者多加，并且CCK-8试剂加入量很少，如果不小心沾到壁上，很可能会导致结果的可重复性不是很好。相比较而言，MTT试剂价格低廉，试剂颜色为黄色，加入即刻显色，不容易产生漏加现象，缺点是步骤繁琐，由于其生成产物为水不溶性的，需要有机溶剂(如DMSO、异丁醇等)才能溶解，DMSO不仅具有一定的细胞毒性[8]，且对人体也有一定的危害。此外，MTT法在溶解Formazan之前，需要先吸弃培养液，因此此法不太适用于悬浮细胞，这也造成了一定的局限性，而且在溶解产物Formazan这一步骤中，还有可能会因Formazan溶解不了或溶解不充分，造成一定的结果偏差。针对传统MTT法的不足之处，研究人员又进一步提出了改良的MTT法，可在不吸出培养液的情况下，通过添加一些有机溶剂如酸化SDS[9]、SDS-DMF酸性溶解液[10]等，可使Formazan直接溶解，并取得了不错的效果。

自MTT法建立以来，不断被改良，凭借其经济、数据稳定、无放射性污染等优点已被广泛用于细胞毒性试验[11]、生物活性因子的活性检测[12]、肿瘤细胞药敏检测[13]、抗肿瘤药物大规模筛选[14]等。而且目前针对细胞毒性的检测，《美国药典》中已采用MTT法进行定量测定[15]。综合比较发现，MTT法较CCK-8法应用前景更为广阔，且相信随着MTT法的不断改进和完善，势必会在实验领域占据重要地位。

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Comparative Study on the Optimal Experiment Conditions between MTT Assay and CCK-8 Assay in Rabbit Retinal Pigment Epithelial Cell

YANG Dongping1YANG Xiaoxu1YU Yang1,2*

1.Traditional Chinese Medical College of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China；2.Key Laboratory of Ministry of Education to the Modernization of Hui Medicine Department, Yinchuan 740004，China

Objective To investigate optimal experiment conditions between MTT assay and CCK-8 assay in rabbit retinal pigment epithelial cells, and compare the advantages and disadvantages of the two methods.Methods Rabbit retinal pigment epithelial cells of the fifth generation were studied. The activity of rabbit retinal pigment epithelial cells were detected respectively with MTT reagent and CCK-8 reagent. Results For MTT assay, the best wavelength was 570nm, the best test was 4h after adding reagent, the number of rabbit retinal pigment epithelial cells within the range of 1.25×104～2×105; For CCK-8 assay, the best wavelength was 450nm, the best test was 4～6h after adding reagent, the suitable cell detection range is 1.25×104～1×105. Conclusion MTT assay is better than CCK-8 assay in the aspects of detection range and incubation time, and MTT is superior to CCK-8 in proliferation assay.

MTT ; CCK-8; Rabbit Retinal Pigment Epithelial Cells; Cell Activity

国家自然科学基金(项目编号：81360557)。

杨冬萍(1990-)，女，回族，硕士研究生在读，研究方向为中医药对眼底病的防治。E-mail: 948319488@qq.com

俞洋(1973-)，男，回族，教授，博士，硕士研究生导师，研究方向为中医药对眼底病的防治。E-mail: yaon999@126.com

R-332

A

1007-8517(2017)06-0031-04

2017-01-17 编辑：梁志庆)