8种五味子木脂素类化合物对羧酸酯酶2的抑制作用

李洁＊，舒恒＊，姜永珊，吴敬敬，金强，胡晋红

（1.第二军医大学附属长海医院药学部，上海200433；2.上海中医药大学附属第七人民医院药学部，上海200137；3.大连医科大学中西医结合系，辽宁大连116044；4.中国科学院大连化学物理研究所药用资源开发研究组，辽宁大连116023）

8种五味子木脂素类化合物对羧酸酯酶2的抑制作用

李洁1，2＊，舒恒3＊，姜永珊3，吴敬敬4，金强4，胡晋红1

（1.第二军医大学附属长海医院药学部，上海200433；2.上海中医药大学附属第七人民医院药学部，上海200137；3.大连医科大学中西医结合系，辽宁大连116044；4.中国科学院大连化学物理研究所药用资源开发研究组，辽宁大连116023）

目的考察8种五味子木脂素类化合物体外对羧酸酯酶2（CES2）活性的抑制作用，并对CES2强抑制剂进行草药-药物相互作用（HDI）风险预估。方法采用荧光素二乙酸酯（FD）作为CES2的特异性荧光探针底物，加入人肝微粒体（HLM），将8种五味子来源的化合物单体五味子甲素、五味子酚、五味子酯戊、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛J、戈米辛G和戈米辛O，分别与FD在37℃条件下共同孵育10 min，以DMSO作为对照，荧光酶标仪测定孵育液中FD代谢产物荧光素的生成量，计算残余活性及半数抑制浓度（IC50），进一步进行体内的HDI风险预估。结果五味子甲素和五味子酚在100μmol·L-1浓度下可使CES2残余活性分别降至DMSO对照组的14.5%和15.3%（P＜0.01），其IC50为8.06和8.91μmol·L-1，其余6种木脂素对CES2抑制作用较弱；HDI风险预测结果表明，五味子甲素或五味子酚与CES2底物共用时，引起药物暴露水平分别增加11.24倍和0.40倍。结论五味子甲素和五味子酚对CES2具有强抑制作用，联合使用五味子相关中药制剂时，需要警惕HDI风险的发生，防止出现血药浓度大幅增加而诱发药物不良反应。

五味子木脂素；羧酸酯酶2；草药-药物相互作用；减毒增效

五味子（Schisandra chinensis）是国家公布的药食同源品之一，被广泛用于医药及保健食品行业。它含有多种化学成分，包括木脂素类、三萜类、倍半萜类、挥发油、多糖、黄酮、有机酸和氨基酸等，其中主要活性成分为木脂素类化合物，包括五味子甲素（deoxyschizandrin）、五味子酚（schisanhe⁃nol）、五味子酯戊（schisantherin E）、五味子醇甲（schisandrol A）、五味子醇乙（schisandrol B）、戈米辛J（gomisin J）和戈米辛G（gomisin G）等［1］。此外，从南五味子中提取出一种新的二苯环辛二烯木脂素类化合物甲基-戈米辛O（gomisin O）［2］。五味子木脂素类化合物中，五味子甲素在体内和体外均可非竞争性抑制大鼠肝微粒体酶CYP3A的活性［3］，但木脂素类化合物对羧酸酯酶（carboxyles⁃terases，CES）的抑制作用尚未见报道。

CES属丝氨酸水解酶家族，广泛分布于哺乳动物体内，在肝、小肠和肺等器官中含量相对较高［4］。CES与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关，并参与脂质运输和代谢，能有效催化酯类和酰胺类化合物水解［5］，还可参与信号跨膜转导和保持生物膜的完整性［6］。哺乳动物的CES依氨基酸同源性可分为5类［7］，包括人类的在内绝大部分属于CES1和CES2家族［8-10］。CES1在肝中高表达，并在巨噬细胞、肺上皮细胞、心和睾丸等组织中存在，在胃肠道中几乎不表达［11］。CES2则只在小肠、结肠、肾、肝、心、脑组织和睾丸中存在［12］。CES2主要水解较大乙醇基和较小乙酰基的底物，如阿司匹林、普鲁卡因和伊立替康（irinotecan，CPT-11）等，而CES1则主要水解较小乙醇基和较大乙酰基的底物，如可卡因、氯吡格雷和奥司他韦等［13］。

Tucker等［14］提出了一个利用体外抑制数据和体内药物浓度来判断发生药物相互作用的可能性的指导原则，该原则以抑制剂浓度与抑制常数的比值Cmax/IC50为参考。基于此，FDA已明确提出药物相互作用的判断标准，即Cmax/IC50＞1.0，临床上很可能会引起药物相互作用；0.1≤Cmax/IC50≤1.0，有可能会引起药物相互作用；Cmax/IC50＜0.1时，几乎不发生药物相互作用［15］。

本研究采用中药五味子中的8种木脂素类化合物体外作用于CES2，通过研究它们对CES2的体外抑制活性发现天然CES2抑制剂，以期在临床用药过程中，使用阿司匹林、普鲁卡因和CPT-11等CES2底物药物并同时联用五味子相关中药制剂时，预先警惕草药-药物相互作用（herb-drug inter⁃action，HDI）发生的风险，防止出现血药浓度大幅增加而诱发药物不良反应。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

标准品：五味子甲素（批号130614）、五味子酚（批号131028）、五味子酯戊（批号16071107）、五味子醇甲（批号140303）、五味子醇乙（批号140122）、戈米辛J（批号16092602）、戈米辛G（批号16042106）和戈米辛O（批号16090601），均购自四川省维科奇生物科技有限公司，纯度均＞98%，其化学结构式见图1。磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾（KH2PO4）（国药集团化学试剂有限公司）；人肝微粒体（human livermicrosome，HLM）（瑞德肝脏疾病研究有限公司）；乙腈（acetonitrile）（赛默飞世尔科技有限公司）；二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（美国TEDIA试剂公司）；荧光素二乙酸酯（fluores⁃cence detection，FD）（上海化成工业发展有限公司）。SynergyH1全功能酶标仪（美国宝特公司）。

1.2 CES2筛选实验和IC50测定

以FD为CES2特异性荧光探针底物，将其加入HLM进行水解，水解反应在磷酸钾缓冲液（phos⁃phate buffer solution，PBS）100 mmol·L-1（pH7.4）中进行。FD经由CES2代谢生成荧光素，通过测定荧光素强度判断CES2的酶活性。

1.2.1 从8种五味子木脂素类化合物中筛选CES2抑制剂

在96孔板中进行筛选，8种五味子木脂素类化合物分别设1，10和100μmol·L-13个浓度，200μL反应体系〔1μL五味子木脂素类化合物单成分+1μL HLM 20 g·L-1+197μL PBS 100 mmol·L-1+1μL FD 15μmol·L-1〕中［16］，置于37℃恒温振荡孵育10 min，向反应体系中加入等体积冰乙腈剧烈振荡终止反应，经20 000×g，4℃离心20 min去除蛋白质，取上清液放入荧光酶标仪，检测其代谢产物的荧光强度（fluorescence intensity，FI），FD水解产物最大吸收光和发射光波长分别为480和520 nm。8种五味子木脂素类化合物对CES2的抑制效应用残余活性表示，对照组以等体积的溶剂〔1μL DMSO（1%，V/V）〕替代，残余活性的计算方法为：残余活性（%）=药物组FI/对照组FI×100%。

Fig.1 Chemical structures of eight lignans derived from Schisandra chinensis.

1.2.2 8种五味子木脂素类化合物IC50测定

在200μL反应体系中，每种五味子单成分的终浓度分别设0.01，0.1，1，5，20，50，100，200和250μmol·L-1共9组。其他实验步骤参考1.2.1，反应10 min后，加入等体积冰乙腈，充分混匀终止反应，然后20 000×g离心10 min，取上清液放入荧光酶标仪进行检测。实验数据采用Prism软件包（Version 5.01，GraphPad，San Diego，CA）进行IC50值的拟合求解，IC50与抑制强度呈反比。

1.2.3 五味子木脂素类化合物与CES2代谢药物相互作用风险的预测

根据已有文献报道，五味子甲素在五味子果实中含量为0.03～39.19 mg·g-1［1，17-21］，五味子酚为0.01～1.48 mg·g-1［17-18］，按五味子中药材的通常使用量（5 g）及人体平均血液体积（5.2 L）可推算出五味子甲素的最大血药浓度为0.07～90.6μmol·L-1，五味子酚为0.02～3.54μmol·L-1。出于预测的目的，用临床最高剂量下的血药浓度Cmax来估计浓度-时间曲线下面积（area underthe concentration-time curve，AUC）的改变，计算8种五味子木脂素类化合物导致CES2代谢药物的体内暴露水平变化Cmax/ IC50，即AUC增幅。参考FDA提出的药物相互作用的判断标准［15］，预测临床HDI的风险。

1.3 统计学分析

实验结果数据以x±s表示。统计学分析均采用Prism软件包（Version 5.01，GraphPad，San Diego，CA）。采用单因素方差分析，组间两两比较采用two-tailed Student′s t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 8种五味子木脂素类化合物对CES2的抑制作用筛选及IC50

2.1.1 筛选

8种五味子木脂素类化合物对CES2抑制作用的筛选结果（图2）显示，与对照组相比，五味子甲素、五味子酚、五味子酯戊、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛J、戈米辛G和戈米辛O对CES2活性均有不同程度的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），在100μmol·L-1时，五味子甲素和五味子酚对CES2的残余活性分别为14.5%和15.3%，戈米辛J、戈米辛G和五味子酯戊组分别为33.3%，40.6%和35.2%，五味子醇甲、五味子醇乙和戈米辛O分别为51.6%，43.8%和70.7%。

Fig.2 Inhibitory effects of eight lignans derived from S.chinensis on carboxylesterases 2(CES 2).1μL lignans of S.chinensis 1，10 or 100μmol·L-1+1μL human liver microsome 20 g·L-1+1μL fluorescein diacetate 15μmol·L-1，197μL PBS 100 mmol·L-1was added to 200μL to start the reaction，after 10 min，remaining activity was calculated.Remaining activity（%）= fluorescence intensity（FI）of drug group/FI of control group× 100%.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding controlgroup.

2.1.2 IC50

8种五味子木脂素类化合物不同浓度下对CES2的残余活性结果如图3。经Prism软件包拟合计算，五味子甲素、五味子酚、五味子酯戊、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛J，戈米辛G和戈米辛O的IC50依次为8.06，8.91，38.6，105，129，48.7，19.5和188μmol·L-1。该结果提示，五味子甲素和五味子酚对CES2的抑制作用较强（IC50＜10μmol·L-1），戈米辛J、戈米辛G和五味子酯戊对CES2的抑制作用中等（IC50＞10μmol·L-1），五味子醇甲、五味子醇乙和戈米辛O对CES2作用较弱（IC50＞100μmol·L-1）。

2.2 8种五味子木脂素类化合物与CES2代谢药物相互作用风险的预测

8种五味子木脂素类化合物与CES2代谢药物联用在体内的HDI风险预测结果（表1）显示，五味子甲素的Cmax/IC50最大值1.0，可以导致CES2代谢药物的体内暴露水平最大增加11.24倍，临床上很可能会引起药物相互作用；五味子酚的Cmax/IC50最大值在0.1～1.0之间，可导致CES2代谢药物的体内暴露水平最大增加0.40倍，有可能会引起药物相互作用。

Fig.3 Remaining activity of eight lignans from S.chinensis at different concentrations toward CES2.See Fig.2 for the treatment.Remaining actitity（%）=FIofdruy group/FIofcontrolgroup×100%.

Tab.1 Herb-drug interaction risk prediction between lignans and CES2-metabolizing drugs

3 讨论

本研究采用了体外代谢孵育方法，测定了五味子8种木脂素类化合物对HLM中CES2的抑制作用。研究结果表明，五味子甲素和五味子酚对CES2的体外抑制作用较强，其IC50分别为8.06和 8.91μmol·L-1。依据风险预测评估，对两者在体内的HDI风险进行了预估。结果表明，五味子甲素发生HDI风险的可能性较高；五味子酚有一定的HDI风险。五味子是临床常用中药，五味子醇甲和五味子醇乙在五味子果实中含量较高，但鉴于其IC50＞100μmol·L-1，预测其发生HDI的可能性几乎不存在；戈米辛J、戈米辛G、戈米辛O和五味子酯戊IC50也较高，而其在五味子果实中含量低，故预测它们诱发HDI风险的可能性很小。按照中药五味子的常规使用剂量，预估五味子甲素在人体的最大血药浓度为90.6μmol·L-1，远高于其IC50（8.06μmol·L-1）；相比之下，五味子酚的人体最大血药浓度低于五味子甲素，仅可达3.54μmol·L-1，略低于其IC50（8.91μmol·L-1）。其余6种木脂素类化合物对CES2的抑制作用较弱，其IC50均＞10μmol·L-1。预测结果提示，五味子甲素和五味子酚可以强烈抑制CES2，高剂量下有可能会引发HDI。当口服五味子或其提取物后，五味子甲素和五味子酚在体内也可能会对经由CES2代谢清除的药物产生抑制作用。因此，在临床用药过程中，当使用阿司匹林、普鲁卡因和CPT-11等CES2底物药物，同时联合使用五味子相关中药制剂时，需要警惕它们的主要化学成分能否通过抑制CES2而引发HDI风险，防止出现血药浓度大幅增加而诱发药物不良反应。因此，当五味子制剂与CES2底物药物同用时，CES2底物药物应当适度减量。

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Inhibitiory effect of eight lignan compounds of Fructus Schisandrae chinensis on carboxylesterase 2

LIJie1,2＊,SHU Heng3＊,JIANG Yong-shan3,WU Jing-jing4,JIN Qiang4,HU Jin-hong1
(1.Department of Pharmacy,ChanghaiHospital,Second Military MedicalUniversity,Shanghai 200433, China;2.Department of Pharmacy,Seventh People's Hospitalof ShanghaiUniversity of TCM, Shanghai 200137,China;3.Department of Integrated Traditionaland Western Medicine, Dalian MedicalUniversity,Dalian 116044,China;4.Laboratory of Pharmaceutical Resource Discovery,Dalian Institute of ChemicalPhysics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China)

OBJECTIVETo investigate the inhibitory effect of eight lignan compounds of Fructus Schisandrae chinensis in vitro on carboxylesterase 2(CES2)and to estimate the herb-drug interaction (HDI)risks of strong CES2 inhibitors selected from the above compounds.METHODSFluorescein diacetate(FD)was employed as a specific fluorescentprobe of CES2.The residualactivity of CES2 was detected in human liver microsomes after the intervention with deoxyschizandrin,schisanhenol, schisantherin E,schisandrol A,schisandrol B,gomisin J,gomisin G,and gomisin O at37℃for 10 min, respectively.1%DMSO served as control.Residual activity of CES2 was assessed with metabolite production of FD detected by fluorescentintensity,combined with IC50values of the above compounds to predict HDIrisks between lignans and CES2-metabolizing drugs.RESULTSCompared with control group,the activity of CES2 was significantly inhibited by deoxyschizandrin and schisanhenol(P＜0.01), with IC50values of 8.06μmol·L-1and 8.91μmol·L-1,respectively.The other six lignans compounds exhibited mild inhibitory effect on CES2.HDI risk prediction of deoxyschizandrin or schisanhenolindicated thatexposure of CES2-metabolizing drugs mightincrease 11.24 and 0.40 times,respectively.CONCLUSIONDeoxyschizandrin and schisanhenol exhibit strong inhibitory effects against CES2 in vitro so that potential HDIrisks should be taken into accountduring administration ofdrugs containing Fructus Schisandrae chinensis.

Schisandra chinensis lignans;carboxylesterase 2;herb-drug interaction;synergism and attenuation

HU Jin-hong,E-mail:hjhong2006@gmail.com,Tel:(021)31162328;JIANG Yong-shan,Tel: (0411)83635963-7265,E-mail:yongshanj@hotmail.com

R969.2，R285.1

：A

：1000-3002-（2017）04-0340-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.007

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81672961);and Talents Training Program of the Seventh People′s Hospitalof ShanghaiUniversity of TCM(XX2015-04)

2016-10-15接受日期：2017-03-17）

（本文编辑：贺云霞）

国家自然科学基金（81672961）；上海市第七人民医院人才培养计划（XX2015-04）

李洁，女，硕士研究生，药师，主要从事临床药学研究；舒恒，女，硕士研究生，医师，主要从事中西医结合临床研究。

胡晋红，E-mail：hjhong2006@gmail.com，Tel：（021）31162328；姜永珊，Tel：（0411）83635963-7265，E-mail：yongshanj@hotmail.com

＊共同第一作者。

＊Co-firstauthor.