丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制

赵海洲，陈永星，李楠，杨旭，李赛男，刘文华

（肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061）

丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制

赵海洲，陈永星，李楠，杨旭，李赛男，刘文华

（肇庆学院生命科学学院，广东肇庆526061）

目的研究丁氟螨酯对人经神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制。方法加入丁氟螨酯0.03，0.06，0.125，0.25，0.5，1，2，2.6，4，6，8和16 mmol·L-1处理SH-SY5Y细胞48 h，MTT法测定细胞存活；DCFH-DA荧光探针标记法检测细胞内活性氧（ROS）水平；JC-1标记法检测细胞线粒体膜电位；Hoechst33258染色观察细胞核形态；碘化丙啶（PI）染色和流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡；Western蛋白印迹法检测磷酸化P38蛋白（p-P38）和磷酸化Jun激酶（p-JNK）表达水平。结果与溶剂（DMSO）对照组相比，共孵育48 h后，丁氟螨酯≥0.06 mmol·L-1时可降低细胞存活率（P＜0.05），且随浓度增高细胞存活率有降低趋势，IC50为2.6 mmol·L-1；丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1组细胞ROS水平升高（P＜0.01），线粒体膜电位下降（P＜0.01）。Hoechst 33258染色结果显示，丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1组SH-SY5Y细胞出现颗粒状荧光，细胞核固缩和崩解；流式细胞仪检测结果显示，丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1组细胞凋亡率由DMSO对照组的（0.7±0.1）%分别上升至（6.7±0.1）%，（72.4±8.6）%和（90.7±3.2）%（P＜0.01）；丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组G1期细胞较DMSO对照组明显增加（P＜0.01）；Western蛋白印迹结果表明，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组p-JNK表达均升高（P＜0.01），丁氟螨酯6 mmol·L-1组p-P38表达水平增加（P＜0.01）。结论丁氟螨酯可能通过氧化损伤、激活P38蛋白和JNK蛋白诱导SH-SY5Y细胞G1期阻滞和凋亡。

丁氟螨酯；SH-SY5Y细胞；细胞凋亡；活性氧；应激反应

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性死亡，其致病原因主要有年龄老化、遗传因素和环境毒素等［1-2］。含氟农药主要用作杀虫剂、除草剂和杀螨剂等，在农业生产以及日常生活中使用较为普遍，一般认为这类农药对人的毒性相对较小［3］。但近期研究表明，含氟农药可能具有潜在的神经毒性，如氟虫腈引起人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞凋亡［4］；大鼠黑质纹状体多巴胺能神经元减少［5］；高效三氟氯氰菊酯降低发育期大鼠纹状体酪氨酸羟化酶蛋白表达［6］；氟啶胺引起SH-SY5Y细胞凋亡［7］。

丁氟螨酯（cyflumetofen）是由日本大冢公司开发的新型含氟农药，于2007年获准公开销售，主要用于果树、蔬菜和茶树等农作物和花卉上螨虫、红蜘蛛的防治，尤其对幼螨的杀毒作用更强。丁氟螨酯对螨虫和红蜘蛛具有特异性毒杀效果，对昆虫类和鱼类等其他生物的毒性较低，其防治效果较以往的杀螨剂具有较大优势，一般认为丁氟螨酯杀螨毒性专一，对其他物种毒性较小。目前研究主要集中在合成、活性研究及环境残留测定上［8-10］。联合国粮农组织和世界卫生组织会议证实，丁氟螨酯对于雄性大鼠具有潜在的致癌作用［11］。Yoshida等［12］发现，丁氟螨酯长期经胃给药引起大鼠肝、肾肿大，肾上腺皮质细胞空泡化。Li等［13］认为，丁氟螨酯在水中的主要降解产物B-3具有较强的致突变作用。丁氟螨酯已在15个国家广泛注册和应用［14］，但关于其神经毒性方面的研究未见文献报道。因此，开展其神经毒性的研究具有重要意义。

SH-SY5Y细胞的形态和生理生化功能类似于神经细胞，常作为细胞模型用于神经毒理药理研究［15］。本研究使用SH-SY5Y细胞研究丁氟螨酯的毒性作用，并进一步探讨其毒性机制，为该农药的合理使用提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

SH-SY5Y细胞购自中山大学细胞库；丁氟螨酯（纯度95%，美国Alfa Chemistry公司）；胎牛血清、DMEM高糖培养基、青链霉素、胰蛋白酶和PBS（美国Gibco公司）；MTT、DMSO、Hoechst 33258和碘化丙锭（美国Sigma公司）；活性氧（reactive oxy⁃gen species，ROS）、线粒体膜电位（△Ψm）、BCA蛋白质定量试剂盒及细胞裂解液（江苏碧云天公司）；ECL发光液（上海天能科技有限公司）；兔抗人Jun激酶（Jun kinase，JNK）2/MBP多克隆抗体、兔抗人磷酸化SAPK/JNK（p-JNK）（Thr183/Tyr185）（81E11）单克隆抗体、兔抗人P38蛋白（D13E1）XP单克隆抗体和兔抗人磷酸化P38蛋白（p-P38）（Thr180/Tyr182）（12F8）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；兔抗人β肌动蛋白多克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；HRP标记山羊抗兔IgG二抗（美国Merck Millipore公司）；其余试剂均为市售国产分析纯。

HEARACELL 150i二氧化碳培养箱和离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ELx800型酶标仪（美国BioTek公司）；ECLIPSE TS100倒置和ECLIPSE Ci正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；FC500流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；Tanon 4200全自动化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 细胞培养

SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1及链霉素100 mg·L-1的高糖DMEM培养基在恒温37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养，每隔2～3 d传代1次，用对数期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞存活

每孔1×104个SH-SY5Y细胞接种于96孔培养板，培养24 h后用于实验。丁氟螨酯用DMSO溶解，初浓度为1 mol·L-1，使用时用不含血清的DMEM培养基稀释后加入96孔板中，药物终浓度范围0.03～16 mmol·L-1。实验设立空白组（只有培养基，无细胞）、溶剂（0.09%DMSO）对照组和丁氟螨酯（0.03～16 mmol·L-110个浓度梯度）组，每组设3复孔，作用48 h后每孔加入200μL MTT（0.5 g·L-1），孵育4 h，弃上清，加入200μL DMSO溶解甲瓒，酶标仪测吸光度值（A490nm）。细胞存活率（%）=（药物组A490nm－空白组A490nm）/（对照组A490nm－空白组A490nm）×100%，实验重复3次。使用Excel自带函数拟合曲线，结合实验数据作图得出IC50［16］。

1.4 荧光探针DCFH-DA检测SH-SY5Y细胞中ROS水平

每孔6×104个SH-SY5Y细胞接种于24孔培养板，设丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1组，同时设溶剂（DMSO）对照组，培养48 h后细胞染色。参照ROS检测试剂盒说明书用荧光探针DCFH-DA进行ROS检测。荧光显微镜下随机选取视野拍照，用荧光强度对ROS进行半定量分析。实验重复3次。

1.5 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位

按1.4分组处理细胞，参考线粒体膜电位检测试剂盒说明书用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位，荧光显微镜下随机选取视野拍照，实验重复3次。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。用红绿荧光的比值表示线粒体膜电位。实验重复3次。

1.6 Hoechst33258染色观察细胞核

24孔板中加入无菌玻片，使用100 mg·L-1多聚赖氨酸浸泡30 min，PBS洗3次，每孔接种6×104细胞。设丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1处理组，同时设溶剂（DMSO）对照组，细胞培养48 h后，加入4%多聚甲醛固定液于4℃作用15 min，PBS洗2次，然后加入Hoechst 33258 10 mg·L-1室温避光染色10 min，PBS洗2次。将玻片取出，倒扣于载玻片上，随机选取视野在荧光显微镜下拍照，观察细胞核形态改变。实验重复3次。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

按1.6分组处理细胞，细胞培养48 h后，0.25%胰酶消化，取细胞1×106～2×106，3 mL PBS洗1次，3 mL预冷PBS重悬细胞，1000×g离心5 min，弃上清。加入500μL PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个细胞，用终浓度75%乙醇-20℃过夜固定。上机前，取固定好的细胞，4℃，1000×g离心5 min，弃固定液，用预冷PBS洗涤细胞1次以去除乙醇，4℃，1000×g离心5 min，弃上清。加500μL预冷PBS重悬细胞，加50μL RNA酶（1 g·L-1），37℃水浴30 min。之后加碘化丙锭（终浓度为50 mg·L-1，含0.1%Triton X-100），4℃避光染色30 min。细胞转移至流式管，使用流式细胞仪收集3×104细胞检测细胞凋亡和细胞周期。细胞凋亡率（%）=亚二倍体峰细胞数/总细胞数×100%。激发波长488 nm，发射波长630 nm。

1.8 Western蛋白印迹法检测P38和JNK蛋白表达

SH-SY5Y细胞接种于6 cm培养皿，待第2天细胞达到70%～80%融合度，按1.6分组处理细胞，用PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃摇床轻轻振荡裂解细胞，15 000×g离心15 min后吸取上清，BCA法测定总蛋白质含量。Western蛋白印迹检测应激蛋白P38，p-P38，JNK和p-JNK的表达。以Image J软件分析各条带积分吸光度（integrated absorbance，IA），待测蛋白的相对表达水平用IA目标蛋白/IAβ肌动蛋白的比值表示。

1.9 统计学分析

实验结果数据以x±s表示，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）和t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 丁氟螨酯对细胞存活率的影响

不同浓度丁氟螨酯处理SH-SY5Y细胞48 h细胞存活率见图1。与DMSO对照组相比，丁氟螨酯0.06 mmol·L-1时SH-SY5Y细胞存活率开始下降（P＜0.05）；＜2 mmol·L-1时细胞存活率降低较缓慢（P＜0.01）；＞2 mmol·L-1时细胞存活率迅速降低（P＜0.01）。随着丁氟螨酯浓度增加，其对细胞的抑制作用有增强趋势，48 h半数抑制浓度（IC50）为2.6 mmol·L-1。

Fig.1 Effect of cyflumetofen on cell viability by MTT assay.SH-SY5Y cells were exposed to different concentra⁃tions of cyflumetofen for 48 h at 37°C.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with DMSO control（0）group.

2.2 丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞氧化应激的影响

相差显微镜明场照片表明（图2A），DMSO对照组细胞形态正常，呈梭形；丁氟螨酯1 mmol·L-1尚未改变细胞形态；2 mmol·L-1组部分细胞异常变圆；4和6 mmol·L-1组细胞形态变化较大，全部皱缩变圆。

DCFH-DA探针结果（图2A和B）表明，与DMSO对照组相比，丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1组SH-SY5Y细胞ROS水平显著增加（P＜0.01），丁氟螨酯1和2 mmol·L-1组细胞ROS分别是DMSO对照组的25和31倍，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组均是DMSO对照组的6倍。

Fig.2 Effect of cyflumetofen on reactive oxygen species（ROS）levels in SH-SY5Y cells detected by DCFH-DA staining.SH-SY5Y cells were treated with cyflumetofen for 48 h. A：the morphology in light field and ROS fluorography，respec⁃tively；B：semi-quantitative resultof ROS.FI：fluorescence intensity. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO control（0）group.

2.3 丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响

JC-1探针结果（图3）表明，DMSO对照组显示明显红色荧光，红绿荧光比为7.3；丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1组绿荧光逐渐增强，红绿荧光比分别下降至3.0，1.8，0.7和0.3（P＜0.01）。提示丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1组线粒体膜电位较DMSO对照组下降。

Fig.3 Effect of cyflumetofen on mitochondrial membrane potential（MMP）in SH-SY5Y cells detected by JC-1 staining.See Fig.2 for the cell treatment.B：the semi-quantita⁃tive result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO con⁃trol（0）group.

2.4 丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞核形态的影响

Hoechst 33258细胞核染色结果显示（图4），DMSO对照组细胞表现为弥漫均匀的低强度荧光，丁氟螨酯2 mmol·L-1组部分细胞有颗粒状亮蓝色点状荧光。与DMSO对照组相比，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组细胞主要表现为核固缩变小，亮蓝色点状聚集颗粒状荧光；有部分细胞的细胞核已发生崩解。上述结果从细胞核形态上验证了细胞凋亡的发生。

Fig.4 Effect of cyflumetofen on SH-SY5Y cell nuclei by Hoechst33258 staining.See Fig.2 for the celltreatment.↑：nucleic accumulation and nuclear shrinkage；△：nuclear dis⁃integration.

2.5 丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞周期和细胞凋亡的影响

细胞周期分析（表1）发现，与DMSO对照组相比，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组G1期细胞比例由48.0%分别上升至61.1%和89.8%（P＜0.01）。流式结果（图5）显示，与DMSO对照组相比，经丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1处理的SH-SY5Y细胞在48 h均检测到明显的亚二倍体峰，细胞凋亡率由（0.7± 0.1）%分别上升至（6.7±0.1）%，（72.4±8.6）%和（90.7±3.2）%（n=3，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of cyflumetofen on cell cycle of SH-SY5Y cells detected by flow cytometry

2.6 丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞p-JNK和p-P38表达的影响

Western蛋白印迹结果（图6）显示，与DMSO对照组相比，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1作用48 h后，细胞p-JNK表达明显增加（P＜0.01）；丁氟螨酯6 mmol·L-1使p-P38表达显著增加（P＜0.01）。丁氟螨酯对细胞JNK和P38的表达水平没有影响（数据略）。

Fig.5 Effect of cyflumetofen on apoptosis of SH-SY5Y cells detected by flow cytometry.A，B，C and D：cyflumetofen 0，2，4 and 6 mmol·L-1group，respectively.

Fig.6 Effect of cyflumetofen on expression of phos⁃phorylated Jun kinase（p-JNK）and p-P38 in SH-SY5Y cells detected by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B is the semi-quantitative re⁃sult of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO control（0）group.

3 讨论

丁氟螨酯于2007年批准上市，目前关于其神经毒理作用暂未见报道。本研究使用SH-SY5Y细胞模型，评价丁氟螨酯的神经毒性和作用机制。研究结果表明，丁氟螨酯0.06 mmol·L-1即能显著抑制细胞生长，随浓度的增加，抑制效果有增强趋势，IC50为2.6 mmol·L-1。丁氟螨酯4和6 mmol·L-1作用48 h后，Hoechst33258染色显示细胞核出现皱缩和大量的凋亡小体。流式细胞仪测定结果表明，在G1峰的左侧检测到亚二倍体峰，提示细胞发生了凋亡，出现细胞G1期阻滞。

环境毒素是散发性PD的主要致病原因，而农药及其残留物是环境毒素的重要来源之一。目前，杀虫剂和除草剂等农药在粮食生产、蔬菜水果和园林绿化等领域普遍使用，给人们带来了重大的安全隐患。一些以前认为是“安全”的农药，采用新检测方法和新毒理模型后，其毒性作用被逐步发现。

PD的病理原因是由于中脑黑质多巴胺能神经元发生退行性死亡，并导致纹状体中多巴胺递质含量减少而发生的。氧化损伤被认为是引起细胞损伤、衰老、凋亡及死亡的重要原因。在过度氧化应激状态下，细胞内ROS急剧增加，导致线粒体膜电位改变、线粒体DNA及电子传递链损伤，线粒体功能失调，最终导致神经元变性死亡［17-18］。线粒体膜通透性增加，膜电位降低是细胞早期凋亡的标志。本研究结果表明，丁氟螨酯1和2 mmol·L-1对SH-SY5Y细胞生长抑制作用还相对较小，细胞形态基本正常，但细胞内ROS水平已急剧升高；4和6 mmol·L-1组ROS水平比1和2 mmol·L-1组相对较低，其原因可能是4和6 mmol·L-1组细胞已大量死亡并裂解。线粒体膜电位结果显示，丁氟螨酯1 mmol·L-1即引起线粒体膜电位显著降低。上述结果表明，丁氟螨酯可以引起SH-SY5Y细胞氧化损伤，在高浓度的丁氟螨酯作用下，这种损伤又导致了细胞凋亡和坏死。

细胞凋亡的过程十分复杂多样。多个研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成员JNK和P38参与了凋亡过程调节。百草枯和鱼藤酮通过激活JNK诱导多巴胺能神经细胞凋亡［19-20］；P38的激活参与多巴胺能神经元凋亡、促进PD进程［21-22］。但也有研究报道JNK和P38的激活能够抑制细胞凋亡、增加细胞存活率［23］。本研究结果显示，丁氟螨酯2 mmol·L-1作用48 h对p-JNK和p-P38的表达都没有影响；4 mmol·L-1作用后引起p-JNK显著升高；6 mmol·L-1作用后p-JNK进一步升高，p-P38也明显增加。这些结果与上述丁氟螨酯4和6 mmol·L-1显著抑制SH-SY5Y存活、诱导细胞大量凋亡具相关性，提示JNK和P38参与了丁氟螨酯诱导的SH-SY5Y细胞毒性过程。

综上所述，本研究发现，丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞具有毒性损伤作用，并诱导细胞凋亡和G1期阻滞，其信号通路可能与氧化应激引起的线粒体功能失调、以及应激蛋白JNK和P38的激活有关。丁氟螨酯属新型农药，在国内的需求将可能稳定增长。因此，对其进行全面系统的毒理作用研究十分紧迫和必要。

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Cytotoxicity of cyflumetofen on SH-SY5Y cells and possible mechanism

ZHAO Hai-zhou,CHEN Yong-xing,LI Nan,YANG Xu,LISai-nan,LIU Wen-hua
(Schoolof Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqin g 526061,China)

OBJECTIVETo investigate the cytotoxicity of cyflumetofen for SH-SY5Y cells and the mechanism.METHODSSH-SY5Y cells treated with cyflumetofen 0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,2.6, 4,6,8 and 16 mmol·L-1for 48 h.Cellsurvivalwas measured with MTT assay.The reactive oxygen species (ROS)was determined with the DCFH-DA probe,and mitochondrialmembrane potential(MMP)was detected by JC-1 staining.The morphologicalchanges in cellnucleiwere observed with Hoechst33258 staining.Cellcycle and apoptosis were determined by flow cytometry.The protein levels ofphosphorylated Jun Kinase(p-JNK)and p-P38 were measured by Western blotting.RESULTSCompared with solvent (DMSO)control group,cyflumetofen(≥0.06 mmol·L-1)inhibited the proliferation of SH-SY5Y cells obviously(P＜0.05),and the IC50was 2.6 mmol·L-1.MMP declined and ROS levels increased significantly in cyflumetofen 1,2,4 and 6 mmol·L-1groups(P＜0.01).Cyflumetofen 2,4 and 6 mmol·L-1induced nucleic accumulation,nuclear shrinkage and disintegration in SH-SY5Y cells.Apoptosis rates of cyflu⁃metofen 2,4 and 6 mmol·L-1groups increased from(0.7±0.1)%in DMSO controlgroup to(6.7±0.1)%, (72.4±8.6)%and(90.7±3.2)%(P＜0.01).Cyflumetofen 4 and 6 mmol·L-1induced G1phase cellcycle arrest(P＜0.01).In addition,Western blotting showed thatcyflumetofen 4 and 6 mmol·L-1up-regulated the expression ofp-JNK(P＜0.01),while the levelofp-P38 in SH-SY5Y cells was increased in cyflumetofen 6 mmol·L-1group(P＜0.01).CONCLUSIONCyflumetofen induces cell damage,apoptosis and G1phase cellcycle arrest in SH-SY5Y cells.The mechanism may be associated with oxidative damage, and activation of P38 and JNK stress-response pathways.

cyflumetofen;SH-SY5Y cells;apoptosis;reactive oxygen species;stress reaction

LIU Wen-hua,E-mail:wenhualiu@hotmail.com

R994.6，R996

：A

：1000-3002-（2017）04-0318-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.004

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31271124);Major Project of Bureau of Education of Guangdong Province(2014KZDXM075);and Innovation Team Project of Bureau of Education of Guangdong Province(2015KCXTD032)

2016-08-24接受日期：2017-03-16）

（本文编辑：贺云霞）

国家自然科学基金项目（31271124）；广东省教育厅重大项目（2014KZDXM075）；广东省教育厅创新团队项目（2015KCXTD032）

赵海洲，硕士，研究实习员，主要从事神经药理毒理学研究。

刘文华，E-mail：wenhualiu@hotmail.com