飞机草链格孢毒素的培养条件、分离及活性测定

李雨龙　张宇　杨叶　赵磊　符旖晴

摘要：【目的】对链格孢菌株LGB100401的产毒培养条件及毒素的除草活性进行评估，为飞机草的生物防治提供理论依据。【方法】以从海南田间染病的飞机草上分离到的链格孢菌LGB100401菌株为材料，采用以生物测定为导向的乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析等方法对LGB100401菌株所产毒素进行分离纯化及产毒条件研究，并采用离体叶片针刺接种法测定38种植物对LGB100401菌株所产毒素的敏感性。【结果】LGB100401菌株可产生毒素并导致飞机草叶片枯死，最适产毒条件为25 ℃、pH 4～6、光暗交替培养15 d。LGB100401菌株分泌的毒素对供试38植物具有选择毒性，其中，供试杂草对链格孢粗毒素不敏感（NS）的有17种、稍敏感（LS）4种、敏感（MS）7种、极敏感（SS） 4种，表现为极敏感的杂草为飞机草、马唐、羽芒菊和赛葵；供试的6种作物中只有水稻表现为敏感（MS），其他5种作物不敏感或表现轻微症状。【结论】飞机草链格孢毒素对飞机草具有较高的抑制活性，具有较高的生防潜力。

关键词： 飞机草；链格孢毒素；产毒条件；分离纯化；除草活性

中图分类号： S451；S476 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0087-05

Abstract：【Objective】The research evaluated toxin production cultural conditions for Alternaria alternata strain LGB100401 and herbicidal activity of the toxin， in order to provide theoretical basis for biological control of Chromolaena odorata. 【Method】A. alternata strain LGB100401 isolated from infected C. odorata in field in Hainan was taken as material. The bioassay-guided ethyl acetate extract and silica gel column chromatographic separation were used to isolate， purify the toxin and research the toxin production conditions. Sensitivity of 38 species of plants to the toxin was tested using detached leaf puncture inoculation method. 【Result】Results showed that LGB100401 could produce toxins which led to necrosis of C. odorata leaf. The optimal cultural conditions for producing toxin were temperature 25 °C， pH 4-6， cultured period 15 d under alternation of light and dark. The toxin had selective toxicity towards the 38 species of plants. Sixteen species were not sensitive（NS） to the toxin， four species were slightly sensitive（LS）， eight species were sensitive（MS） and four species were very sensitive（SS）. The four species which were very sensitive were C. odorata， Digitaria sanguinalis， Tridax procumbent and Malvastrum coromandelianum. Among the six tested crops， only rice was sensitive（MS） to the toxin， the rest five crops were not sensitive or only showed slight symptom. 【Conclusion】Alternaria alternata toxin from C. odorata has strong inhibitory effect on C. odorata. It may be useful for biological control of C. odorata.

Key words： Chromolaena odorata； Alternaria alternata toxin； toxin production condition； separation and purification； herbicidal activity

0 引言

【研究意義】飞机草[Chromolaena odorata （L.） King & Robinson]是国家环境保护总局和中国科学院联合公布的我国首批16种外来入侵物种之一，在海南省广泛分布，对当地的农林牧业、物种多样性和生态系统安全造成了严重危害。由于飞机草生长繁衍快且具有灌木的特性，化学防除和机械防除效果有限。利用天然活性化合物研发新一代除草剂是当前除草剂研究热点之一（程亮和郭青云，2015）。众多研究表明，与直接利用病原真菌作为生物除草剂相比，微生物代谢产物提供了更广阔的生物除草前景。目前，真菌毒素作为一种环保型农药被广泛研究，植物病菌所产生的毒素也是获得除草活性化合物及研究开发新型除草剂的重要来源。【前人研究进展】在真菌产生的毒素中，链格孢属（Alternaria）产生的毒素备受关注，其中，交链格孢[A. alternata（Fr.） Keissler]是一类分布广泛的真菌，其寄主植物超过380种（Mirhosseini et al.，2015）。研究表明，来源于不同罹病植物的链格孢可产生多种毒素成分，对多种杂草具有除草活性（Ghorbani et al.，2000；Mohan Babu et al.，2003；Ostry，2008），是已知病原菌中产生毒素最多的种类。从紫茎泽兰上分离获得的链格孢能产生有致病作用的毒素，并从其代谢产物中分离到细交链格孢菌酮酸（简称TeA毒素），该毒素主要通过抑制紫茎泽兰叶片光系统II的电子传递从而对其产生毒害作用（Chen et al.，2005；Qiang et al.，2006）。此外，链格孢产生的链格孢菌毒素（AAC毒素）具有广谱和快速除草活性，其效果与百草枯相似（Qiang et al.，2010）；引起番茄茎枯病的链格孢菌产生的AAL毒素对龙葵、曼陀罗具有抑制活性（Abbas et al.，1995）。不同来源菌株所产生的毒素存在明显差异，植物病原菌在寄主体外产生的毒素还与其培养条件密切相关，不同培养条件下其毒素活性大小、分泌物质种类、含量多少等均不尽相同（万佐玺等，2001；Varej o et al.，2013）。【本研究切入点】目前，国内利用本土植物病原真菌所产生毒素防除飞机草的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】利用从海南田间染病的飞机草上分离到的1株高毒力链格孢菌，采用硅胶柱层析等方法分离毒素，并采用离体叶片法对其产毒适宜条件及粗毒素的杀草活性进行测定，旨在为飞机草的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

链格孢菌株LGB100401（GenBank登录号KT2095-

89）从海南省自然发病的飞机草叶片上分离获得。包括飞机草在内的38种植物材料（其中杂草32种、作物6种，表1）用于生物测定，植物材料从海南大学环境与植物保护学院教学基地及海口郊区采集。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 粗毒素制备 选用PSK培养液（30 g蔗糖、1 g K2HPO4、1000 mL蒸馏水）进行液体培养。将菌株LGB100401于PDA培养基上培养7 d后，取菌块（直径=5 mm）转接到200 mL的PSK培养液中（500 mL三角瓶），每瓶5个菌块，低转速（90 r/min，6 h/d）振荡与静置结合培养，分别置于不同条件（不同培养时间、不同培养温度、不同pH的培养液和不同光照）下培养。采用真空抽滤法使菌丝与培养液完全分离，获得无菌含毒滤液。将含毒滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，40 ℃旋转蒸发浓缩获得粗毒素。将纯化的粗毒素用无菌水稀释为1 mg/mL的待测液。

1. 2. 2 LGB100401毒素生物活性测定 采用离体叶片针刺接种法测定毒素对飞机草叶片的生物活性。取离体健康的飞机草叶片用自来水冲洗，用1.5%次氯酸钠溶液表面消毒1 min，再用无菌水冲洗并晾干，用无菌解剖针针刺叶片造成轻微伤口（只刺破下表皮）。将10 μL待测液滴到叶片刺伤处，叶片置于含有湿滤纸的培养皿中，28 ℃保湿培养3 d后用十字交叉法测量病斑直径。以无菌水为对照，根据病斑直径比较毒素产量及活性。每处理3次重复。

1. 2. 3 LGB100401最佳产毒条件筛选

1. 2. 3. 1 不同培养时间对LGB100401产毒的影响 将接种有菌块的培养液于28 ℃下培养，培养时间分别为5、10、15、20、25和30 d，按1.2.1的方法制备含毒滤液及纯化毒素，通过生物测定确定最佳培养时间。

1. 2. 3. 2 不同培养温度对LGB100401产毒的影响 将接种有菌块的培养液分别置于15、20、25、30和35 ℃培养15 d后取样，按1.2.1方法制备含毒滤液及纯化毒素，通过生物测定确定最佳培养温度。

1. 2. 3. 3 不同pH的培养液对LGB100401产毒的影响 用10% NaOH和10% HCl分别将培养基的pH调节至3、4、5、6、7、8、9和10，分别接入菌块，置于25 ℃培养15 d后取样，按1.2.1方法制备含毒滤液及纯化毒素，通过生物测定确定培养液最佳pH。

1. 2. 3. 4 不同光照处理对LGB100401产毒的影响 将接种菌块的培养液分别于24 h光照、24 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗3种条件下25 ℃培养15 d后取样，按1.2.1方法制备含毒滤液及纯化毒素，通过生物测定确定最佳光照条件。

1. 2. 4 毒素的柱层析分离 在500 mL具存储球四氟乙烯层析柱中，控制大孔吸附树脂（DA201型）与无菌培养滤液样量比例为1∶10，流速为2 mL/min；将无菌滤液上柱后用90%乙醇洗脱至流出液无色，收集洗脱液，常温下减压浓缩为浸膏，大量获得粗毒素。

100～200目硅胶于110 ℃下烘干2 h后放干燥器中備用。将毒素粗品与硅胶拌样（毒素∶硅胶=1∶2），在60 ℃水浴浓缩成粉末样品。采用干法装柱并上样，取40 g处理好的样品缓慢、均匀撒向层析柱，最后在样品表面缓慢倾倒一层石英砂。先用3～4 L的石油醚淋洗柱子，使柱内硅胶均匀覆盖以彻底清除气泡，同时冲走油状杂质。再按极性由弱到强的顺序用不同的溶剂进行梯度洗脱，分别收集。取10 μL洗脱液，采用离体叶片针刺接种的方法检测LGB100401毒素对飞机草的生物活性，将有活性组分的洗脱液根据洗脱系统和极性进行合并，并再次检测其活性。洗脱系统：A、B、C分别按石油醚∶乙酸乙酯=5∶1、5∶3、1∶1混合，D为乙酸乙酯单剂，E、F分别按乙酸乙酯∶甲醇=5∶2、1∶1混合，G为甲醇单剂。

1. 2. 5 植物敏感性测试 选取健康、长势良好的供测38种植物成熟叶片，以1 mg/mL毒素溶液按1.2.2的方法接种，于28 ℃培养7 d后，检查病斑，并以病斑直径作为植物敏感性指标。敏感性分级（谷祖敏等，2009）：NS为无病斑，不敏感；LS为刺伤点有轻微的侵染，病斑直径≤2 mm，轻度敏感；MS为刺伤点有侵染并有扩展，病斑直径3～6 mm，敏感；SS为严重侵染，病斑直径>6 mm，极敏感。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行单因子分析，利用Tukeys test进行均数间差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 培养条件对LGB100401菌株产毒的影响

液体培养初期，随着培养时间的延长，LGB100401菌株的菌丝快速增长，产毒能力逐渐增强（图1-A）。培养至15 d时，菌丝生长浓密，培养液变色明显；生物活性测定结果表明，此时粗毒素导致的病斑直径最大，与第5、10、25和30 d的病斑直径存在显著差异（P<0.05，下同），说明此时菌株的产毒量最多。培养时间超过15 d后，病斑直径逐渐减小，表明随着培养时间延长菌株产毒量逐渐减少，毒素致病力缓慢下降。

培养温度对菌株产毒有较大影响（图1-B），培养温度为25 ℃时毒素导致的病斑直径最大，与其他温度处理存在显著差异，说明最适宜LGB100401产毒的温度为25 ℃。

培养液pH在5～8时毒素的活性最强，4个处理的病斑直径差异不显著（P>0.05），表明培养液pH在5～8时有助于LGB100401菌株产毒（图1-C）。

光暗交替培养下LGB100401菌株产生毒素活性最强，以全光照处理最差，两处理间存在显著差异（图1-D）。

2. 2 柱层析结果

LGB100401菌株洗脱剂系统每500 mL收集1次，洗脱系统A～G分别收集12、11、10、10、10、11和6瓶洗脱组分。以离体叶片针刺法对每一瓶组分进行生物活性检测，发现主要活性集中在洗脱系统B的第5～7瓶组分、洗脱系统C的第3～4瓶组分、洗脱系统E的第2～8瓶组分、洗脱系统F的第1～5瓶组分，分别将上述洗脱液合并后接种飞机草，3 d后洗脱系统B、C、E、F洗脱液均能使飞机草离体叶片产生明显病斑，其中以E系统（乙酸乙酯∶甲醇=5∶2）洗脱液处理产生的病斑最大，对飞机草的抑制效果最佳（图2）。因此，E洗脱系统为最佳洗脱剂，采用硅胶柱层析梯度洗脱法可大量分离纯化链格孢毒素。

2. 3 毒素的杀草谱和作物安全性评价结果

室内离体叶片接种法测定结果（表1）表明，LGB100401菌株分泌的毒素对供试植物具有选择毒性，1 mg/mL毒素溶液可引起寄主植物和部分非寄主植物叶片萎蔫和坏死。接种毒素后3 d，32种供试杂草中对链格孢粗毒素不敏感（NS）的有17种，占53.125%；稍敏感（LS）4种，占12.500%；敏感（MS）7种，占21.875%；极敏感（SS）4种，占12.500%，分别为飞机草、马唐、羽芒菊和赛葵。供试的6种作物中只有水稻表现为MS，占16.667%，其他5种作物不敏感或表现轻微症状。表现较突出的是菊科植物，有4种表现为极敏感（SS）或敏感（MS）。测定结果表明，除飞机草外，LGB100401毒素对其他3种田间重要杂草马唐、羽芒菊和赛葵也有较高的除草活性，具有潜在生物除草剂效能。

3 讨论

据报道，一般真菌粗毒素含有脂类、糖类、蛋白类、杂环等大量物质，每种物质极性不一，彼此间极可能存在拮抗或增效等作用，且不同植物对其组分敏感性不同；而粗毒素的有效成分一般由多种组分协同作用对植物造成伤害（Ostry，2008）。本研究发现，链格孢菌株LGB100401产生的毒素对飞机草具有较高的除草活性，对海南省常见的杂草羽芒菊、马唐和赛葵也具有很强的毒性，且该粗毒素对大多数供试植物毒性低，表现出较高的选择性，具有潜在的生防价值。

本研究结果表明，链格孢菌株LGB100401产毒的最佳条件是25 ℃、pH 4～6、培养时间15 d及光暗交替培养，在培养15 d后毒素的产生量达峰值后随着时间延长渐渐减少。在不同培养条件下链格孢产毒能力显著不同，说明营养及培养条件直接影响植物病菌的产毒及产生毒素的量，与前人的研究结论（Zonno et al.，2008；郭霞等，2009）一致。粗毒素经过极性适宜的有机溶剂萃取和浓缩，可滤过除去大部分杂质，同时其中包含的多种活性组分得以充分提取和富集，从而发生协同作用，使得对飞机草的活性增强。采用大孔树脂对粗毒素进行大量富集，再用硅胶柱层析梯度洗脱方法适用于链格孢毒素分离纯化，与周兵等（2007）的研究結果一致。

本研究结果表明， LGB100401菌株具有开发为飞机草生物除草剂的潜力。该菌株潜在的应用价值及安全性等深入研究及更详细的信息有待今后进一步探讨。本研究结果有助于了解飞机草链格孢分泌的毒素对杂草的生物控制作用，为今后链格孢毒素的鉴定、开发，以及飞机草的生物防治打下基础。

4 结论

飞机草链格孢菌株LGB100401可产生大量毒素，该毒素对飞机草具有较高的抑制活性，且对植物具有选择作用特性。LGB100401菌株可作为飞机草生物防治的候选物加以研究。

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（責任编辑 麻小燕）