甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

谭秦亮 潘成列 杨丽涛 李杨瑞 欧克纬 朱鹏锦

摘要：【目的】克隆甘蔗體内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）基因，分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析，为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸（ABA）生物合成途径中的作用提供理论依据。【方法】以甘蔗品种桂糖21号为材料，待蔗苗长至5～6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理，利用反转录PCR（RT-PCR）和cDNA未端快速扩增（RACE-PCR）克隆SoNCED基因，应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析，构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况。【结果】克隆获得的SoNCED基因（GenBank登录号JQ314108），cDNA全长为2521 bp，包含1个1827 bp的开放阅读框（ORF），编码608个氨基酸。多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明，SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性，尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高，均达96%。成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED，且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白，确定该蛋白为SoNCED基因的表达蛋白。qRT-PCR结果分析表明，SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达，其中氧化胁迫下其表达量在6 h时达峰值，其他胁迫方式下其表达量在12 h时达峰值。【结论】成功克隆获得甘蔗SoNCED基因，并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程。

关键词： 甘蔗；基因克隆；SoNCED；表达分析；原核表达

中图分类号： S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0001-08

Abstract：【Objective】The research cloned 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene（SoNCED） from sugarcane， analyzed its biological information and expression under stress， in order to provide theoretical basis for further exploring the role of SoNCED gene in sugarcane ABA biosynthesis. 【Method】Taking sugarcane variety Guitang 21 as materials， when sugarcane seedlings grew 5-6 leaves， drought， low temperature，high salt and oxidation stresses were applied to them. SoNCED gene was cloned using reverse transcriptional PCR （RT-PCR） and rapid amplification of cDNA end （RACE-PCR）. Bioinformatics was used to analyze amino acid sequence. Prokaryotic expression vector was established and induced expression of target protein was conducted. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）method was adopted to study the expressions of SoNCED gene under different stresses. 【Result】The cDNA of cloned SoNCED（GenBank accession number JQ314108） in sugarcane was 2521 bp in length with an open reading frame（ORF） of 1827 bp， encoding 608 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that amino acid sequence of SoNCED gene coding was similar to that of other plants. It showed the highest homology with Sorghum bicolor and Zea may， which reached 96%. Prokaryotic expression vector of gene pET-SoNCED was established. And 66.0 kD protein was obtained under IPTG induction， which was determined as expression protein of SoNCED gene. Results of qRT-PCR analysis showed that SoNCED gene was able to express under drought， low temperature， high salt， and oxidation stresses. Under oxidative stress， the expression level reached the peak in 6 h； and the expressions reached the peak in 12 h under other stresses.【Conclusion】Gene SoNCED was cloned from sugarcane. Different stresses are employed to predict the role of SoNCED gene in regulation of abiotic stresses such as drought， high salt， low temperature and oxidation.

Key words： sugarcane； gene cloning； SoNCED； expression analysis； prokaryotic expression

0 引言

【研究意义】甘蔗是我国第一大糖料作物，也是目前极具发展潜力的生物能源作物（李杨瑞和杨丽涛，2009）。甘蔗种植区主要分布在热带亚热带地区，近年来随着全球气候的多变，甘蔗生长正面临着各种逆境胁迫。脱落酸（Abscisic acid，ABA）作为植物体内的重要生长激素，不仅可促进植物正常生长发育，还在响应植物对逆境胁迫的调控过程中发挥着至关重要的作用，如干旱、低温和高盐等非生物胁迫均能引起植物体内内源ABA含量的升高（Seo and Koshiba，2002）。一般植物体内的ABA生物合成有直接和间接两条途径，直接途径由甲瓦龙酸直接合成，间接途径由9-顺式紫黄质或9-顺式新黄质裂解氧化还原而成（Taylor et al.，2000；Seo and Koshiba，2002）。大量研究发现，间接途径是高等植物体内合成ABA的主要途径（Schwartz et al.，2003；Nambara and Marion-Poll，2005），该途径中9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）是催化9-顺式紫黄质或9-顺式新黄质反应的裂解酶，也是ABA生物合成途径中的最关键限速酶（Hwang et al.，2010）。因此，克隆甘蔗NCED基因（SoNCED）并分析其在逆境胁迫下的表达情况，对研究甘蔗ABA生物合成、生理調控分子机理及甘蔗抗逆育种均具有重要意义。【前人研究进展】植物体内NCED基因是一个多基因家族，广泛存在于各种植物中。目前该基因的cDNA在鳄梨（Chernys and Zeevaart，2000）、拟南芥（Iuchi et al.，2001；Tan et al.，2003）、花生（Wan and Li，2005）、大麦（Chono et al.，2006）、马铃薯（Destefano-Beltran et al.，2006）、柱花草（杨锦芬等，2007）、小麦（李康等，2010）和甘蔗（李长宁，2012）等植物上均被成功克隆。转基因植物中NCED基因的过量表达能引起ABA积累和抗旱性增强，过量表达番茄NCED3（Thompson et al.，2000）、豆类NCED1（Qin and Zeevaart，2002）、拟南芥NCED3（Tan et al.，2003）均能导致转基因植株内源ABA含量增加，并提高植株抗旱能力。Thompson等（2000）研究发现，番茄叶片中LeNCED1基因不仅受水分胁迫诱导表达，其表达量还呈昼夜节律性变化。Tan等（2003）研究发现，在拟南芥NCED基因家族中有5个基因在ABA生物合成中具有功能活性，其中AtNCED3被认为是响应干旱胁迫且在ABA生物合成中起主要作用的基因。同时，对玉米、柑橘等作物的研究结果也表明，NCED基因的表达可被不同逆境胁迫所诱导，且其表达量与ABA含量呈协同效应，诱导表达该基因可明显提高玉米和柑橘体内的ABA含量及其抗逆境胁迫的调控能力（Rodrigo et al.，2006；Wan and Li，2006）。【本研究切入点】目前，对SoNCED基因的原核表达分析及该基因在甘蔗逆境胁迫中的机理研究尚无报道。【拟解决的关键问题】采用反转录PCR（RT-PCR）与cDNA末端快速扩增（RACE-PCR）克隆SoNCED基因并进行生物信息学分析，构建原核表达载体pET-SoNCED，然后进行蛋白的诱导与表达分析；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对SoNCED进行逆境胁迫时的表达分析，以期为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗ABA生物合成途径中的作用提供理论依据，同时为甘蔗分子育种提供有效的候选基因。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以甘蔗品种桂糖21号为试验材料，采用沙培育苗，待蔗苗长至3～4叶期后取生长健壮、大小一致的植株移栽到桶中进行土培。当蔗苗长至5～6叶期，选取长势一致的幼苗进行试验处理。试验共设4个处理，分别为干旱胁迫（Water stress，WS）：用15% PEG-6000 （m/v）溶液进行根部浇淋；低温胁迫（Cold stress，CS）：将甘蔗苗置于4 ℃冷库进行低温处理（白昼16/8 h，湿度65%）；NaCl胁迫（NaCl stress，NS）：用100 mmol/L NaCl溶液进行根部浇淋；H2O2胁迫（H2O2 stress，HS）：用10 mmol/L H2O2溶液进行叶面喷施。分别在处理后0、6、12、24、48和72 h采集甘蔗苗+1位叶片，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1. 2 RNA提取及cDNA第一链合成

剪取1 g左右的甘蔗新鲜叶片，用Trizol试剂提取甘蔗总RNA，吸取2 μL RNA用1%琼脂糖凝胶检查其浓度和完整性。cDNA第一链的合成参照反转录试剂盒（Formentas公司）说明进行操作，产物主要用于SoNCED基因的3'-RACE、5'-RACE、全长和开放阅读框克隆；以试剂盒SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa公司）合成qRT-PCR的cDNA第一链。

1. 3 SoNCED基因全长克隆

设计3'-RACE和5'-RACE所需的特异引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成，克隆SoNCED基因全长。3'-RACE-PCR结合接头引物18AP（表1），5'-RACE PCR结合试剂盒中提供的接头引物 UPM，分别进行该基因3'和5'末端扩增。

PCR反应体系50 μL：模板cDNA 2 μL、ddH2O 21 μL、2×Gold Star Best Master Mix 25 μL、10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL。扩增程序：95 ℃预变性10 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行36个循环；72 ℃延伸10 min。连接pMD18-T载体，挑选阳性克隆进行测序。

1. 4 SoNCED基因生物信息学分析

用BioXM2.6分析SoNCED基因的氨基酸序列；使用ProtParam在线软件分析蛋白质的分子量和等电点等基本理化性质；通过PSORT工具进行蛋白质亚细胞定位分析；用MEGA 5.0邻接法（Neighbor-joining，NJ）进行氨基酸序列的多重对比及系统发育进化树分析。

1. 5 SoNCED基因原核表达载体构建

根据SoNCED基因的开放阅读框设计原核表达载体引物pETNCED-F和pETNCED-R下划线部分分别为N端Acc65 I和C端EcoR I内切酶位点（表1），然后进行PCR扩增。反应体系同步骤1.3，反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性50 s；63 ℃退火50 s，72 ℃ 120 s，进行36个循环；72 ℃延伸10 min。连接pMD18-T载体，热激转化DH5α感受态细胞，选择阳性克隆测序。用Acc65 I和EcoR I双酶切测序正确的菌液质粒与pET-30a（+）载体质粒，进行连接与转化、酶切、测序等验证后获得重组质粒pET-SoNCED。

1. 6 SoNCED基因原核表达分析

以1.0 mmol/L IPTG诱导重组质粒的BL21菌液，分别在诱导表达2、4、6和8 h后取样。取样后离心，收集沉淀加3×SDS-PAGE缓冲液150 μL进行裂解变性，沸水浴10 min，冷却后进行SDS-PAGE电泳分析。

1. 7 SoNCED基因在不同逆境胁迫下的定量表达分析

设计qRT-PCR特异性引物RT-NCF和RT-NCR（表1）；以甘蔗基因GAPDH（EF189713）为内参，引物为GAPDH-F和GAPDH-R（表1）。PCR反应体系20 μL：cDNA 2 μL，2×Premix Ex Taq II 10 μL，4 μmol/L正、反向引物各1 μL，双蒸水6 μL。扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，进行45个循环；溶解曲线95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，40 ℃ 30 s。所得数据用2-△△CT（Livak and Schmittgen，2001）进行相对定量分析。

2 结果与分析

2. 1 SoNCED基因全长cDNA克隆

采用Trizol法提取甘蔗叶片总RNA，逆转录后得到cDNA，以cDNA为模板，3'-RACE-PCR扩增得到1090 bp的片段（图1-A），5'-RACE-PCR扩增得到1637 bp的片段（图1-B），拼接得到SoNCED基因全长cDNA序列，长度为2521 bp（图2），GenBank登录号为JQ314108。序列分析结果（图2）显示：3'端存在典型的Poly（A）加尾信号，5'端包含起始密码子（ATG）且符合Kozak法则；包含1个1827 bp的完整开放阅读框（ORF）；编码的蛋白质包含608个氨基酸。

2. 2 SoNCED蛋白质特性及序列分析结果

利用Expasy工具分析可知，SoNCED蛋白理论分子量65.9 kD，等电点（pI）6.04，平均亲水系数（GRAVY）-0.172。通过PSORT工具推测，SoNCED蛋白定位于叶绿体。利用ClustalW2将SoNCED氨基酸序列与玉米、水稻、橘子及番茄的氨基酸序列进行比对分析（图3），预测其N端含有1个典型的由30个氨基酸所组成的叶绿体转运肽结构（划绿线部分），2个双硫键结构（C410和C431），4个铁离子结合催化位点（H-298、H-347、H-412和H-590）。

將SoNCED蛋白与已公开发表的其他物种NCED蛋白进行系统进化关系分析，聚类结果（图4）表明，SoNCED与同为禾本科C4植物的高粱SbNCED（EER93751.1）和玉米ZmVP14（AAB62181.2）蛋白聚于同一进化小分支，与高粱和玉米的同源性均高达96%，同时与其他禾本科植物（水稻、大麦）的亲缘关系也较近，与水稻同源性为87%，与大麦同源性为82%。

2. 3 SoNCED基因原核表达载体的构建

使用引物pETNCED-F和pETNCED-R进行ORF扩增，得到约1827 bp的条带（图5-A）。连接至pMD18-T载体，测序确定该产物为SoNCED基因的完整ORF。使用Acc65 I和EcoR I进行双酶切，结果（图5-B）显示，重组质粒pET-SoNCED双酶切后可切出约1827 bp的片段，测序结果序列与已知基因序列比对完全一致，说明成功构建出SoNCED基因原核表达载体，可进一步进行蛋白诱导表达分析。

2. 4 SoNCED基因的原核诱导表达结果

选用1.0 mmol/L IPTG诱导目的蛋白，采用SDS- PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。结果如图6所示，经IPTG诱导后目的基因能够表达出相应的蛋白，且在4 h时表达量达最大值。pET-SoNCED诱导出的蛋白大小约66.0 kDa，说明构建pET-SoNCED原核表达载体成功，且经IPTG诱导可表达出目的蛋白。

2. 5 不同胁迫处理下SoNCED基因的表达分析结果

用qRT-PCR对SoNCED基因在甘蔗叶片中的实时表达量进行分析，结果（图7）表明，SoNCED基因在甘蔗中的表达模式不尽相同。随胁迫时间的延长，不同处理SoNCED基因均诱导表达，但表达量存在一定差异。在干旱胁迫（WS）、高盐胁迫（NS）和低温胁迫（CS）处理下，SoNCED基因的表达量均呈先升后降的变化趋势，表达量在12 h时达峰值，随后逐渐下降，72 h与未处理时基本持平；在氧化胁迫（HS）处理下，SoNCED基因的表达量呈升—降—升的变化趋势，表达量在6 h时达第1次峰值，72 h时达第2次峰值。

3 讨论

ABA是植物生长过程中重要的调控物质，在器官的萎蔫或衰老、种子成熟与休眠、果实成熟等生理过程中发挥重要作用，且对植物抵抗逆境也有重要的调节作用（Finkelstein et al.，2008；Qiu and Yu，2009）。前人研究发现，在植物的抗逆境胁迫中，NCED是ABA合成的限速酶（Zhu et al.，2007；Zhang et al.，2009），NCED基因可通过调控ABA的生物合成进而调控其含量，如李康等（2010）对普通小麦和近缘种进行的NCED基因半定量表达结果显示，在脱水和盐胁迫处理下NCED基因的表达量均随处理时间的增加而明显增加；在模式植物烟草中过表达酸橘NCED3基因，可明显增加干旱胁迫下烟草体内的ABA含量，而喷施外源ABA可提高酸橘NCED3的表达水平（Neves et al.，2013；Xian et al.，2014）。可见，NCED基因的诱导表达与ABA信号的产生、ABA生物合成及其代谢等存在协同调节作用。

NCED基因受到不同逆境胁迫时有一定的诱导表达，但在不同的逆境胁迫下，表达量及达到峰值的时间存在较大差异。刘江娜等（2010）研究发现，棉花GhNCED基因的表达量在干旱处理6 h后达最大值；李琼琼等（2014）研究发现，大豆GmNCED1基因在受到干旱胁迫12 h时表达量最高，在高盐胁迫24 h时表达量最高；牛志强等（2015）对烟草进行NCED基因表达差异的研究结果显示，干旱胁迫可诱导NCED3-1和 NCED3-2基因过量表达，在处理12 h时表达量达峰值，随后缓慢下降，且与烟草内源ABA的积累规律一致。本研究结果表明，SoNCED基因在甘蔗受到干旱、低温、高盐和氧化4种胁迫时均能诱导表达，其中对氧化胁迫最敏感。在氧化胁迫6 h表达量出现峰值，推测其与该胁迫方式直接处理叶片有关，也与氨基酸亚细胞定位结果相对应，预测该蛋白N端有一个由30个氨基酸组成的典型叶绿体靶转运肽，推测SoNCED蛋白主要存在于地上绿色部位，因此当叶片受到氧化胁迫时SoNCED基因积累量最先达到最高值。在干旱、低温及高盐胁迫12 h时表达量达峰值，可能与ABA大量合成进而调控逆境胁迫有关，具体作用机理还需通过进一步的试验来验证确定。在模式植物烟草中过量表达柱花草植物的NCED基因，发现转NCED基因后的烟草其内源ABA含量及抗干旱胁迫、氧化胁迫和强光胁迫的能力均有所提高，同时提高了烟草的耐旱和耐盐能力（Zhang et al.，2008）。说明NCED基因不仅可提高植物体内的ABA含量，还能有效调节植物对于非生物逆境胁迫的适应能力，也初步证实SoNCED基因参与了甘蔗对逆境胁迫的应答，为深入研究该基因的表达调控及在ABA生物合成途径中的分子机理打下基础。

4 结论

本研究成功克隆获得SoNCED基因，通过原核表达载体可诱导出目的蛋的，并从不同逆境下的表達情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程。

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（責任编辑 王 晖）