香蕉基因组密码子使用偏好性分析

曲俊杰　黄羽　卢江　魏征　尹玲

摘要：【目的】分析香蕉基因组的密码子组成及使用偏好性，探讨影响密码子偏好性形成的主要因素，为提高香蕉外源基因的表达水平及转基因抗病育种提供参考。【方法】以香蕉基因组的36242条高置信蛋白编码基因CDS序列为研究对象，运用CodonW 1.4.4统计分析香蕉基因组的密码子组成及使用参数，确定最优密码子，并分析密码子使用参数间相关性。【结果】从香蕉基因组数据中筛选获得36242个高置信蛋白编码基因CDS序列，平均长度为1035 bp，GC含量为3.0%～75.8%，其中低于20.0%的仅13个序列，全基因组中GC总含量为50.4%；同义密码子第3位出现G或C的频率为52.9%，比出现A或T的频率高。香蕉基因组的有效密码子数（ENC）介于20.0～61.0，平均为50.7；共有17个最优密码子，其中有15个密码子的第3位是G或C；基因编码区的长度和ENC存在正相关，随着基因编码区长度的增加，对以G或C结尾的密码子使用偏好性逐渐降低，且编码区长度为400～600 bp的基因具有较高的基因表达水平。【结论】香蕉基因组中多数基因的密码子使用偏好性较弱，但少部分基因具有强偏好性，偏好使用以G或C结尾的密码子，且偏好性受核苷酸组成、基因突变及自然选择等因素的影响。

关键词： 香蕉；基因组；密码子偏好性；最优密码子

中图分类号： S668.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0014-06

Abstract：【Objective】In order to provide reference basis for improving expression level of exogenous genes in banana and breeding disease-resistant banana， codon composition and usage bias of banana genome were analyzed， and the factors affecting codon usage bias were studied. 【Method】A total of 36242 high-confidence protein sequences in banana genome were used as data source. Codon composition and usage parameters were analyzed to determine optimal codons using CodonW 1.4.4， then correlation between usage parameters were analyzed. 【Result】CDS sequences of 36242 high confidence protein coding genes were selected from Banana Genome Database， their average length was 1035 bp. GC content of these genes ranged from 3.0% to 75.8%， with the average of 50.4% for whole genome. But there were only 13 sequences with GC content being less than 20.0%. Occurrence frequency of G or C in the third position of synonymous codon was 52.9%， which was higher than that of A or T. The effective number of codon（ENC） of banana genome ranged from 20.0 to 61.0， with the average of 50.7. A total of 17 optimal codons were found from banana genome， 15 of which the third position of synonymous codon was G or C. Furthermore， length of gene coding regions was positively correlated with ENC. In other words， the longer gene coding region was， the weaker usage bias of codons ending with G or C was. And genes with length of 400-600 bp showed higher expression level. 【Conclusion】The codon usage bias for most of genes is weak in banana genome， but a few of genes show stronger codon usage bias， and prefer codons ending with G or C. Meanwhile， the codon usage bias of banana genome is affected by some factors like composition of nucleotides， mutations， natural selection etc.

Key words： banana； genome； codon usage bias； optimal codon

0 引言

【研究意義】香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）植物，生长于热带和亚热带地区，大多数国家和地区将其作为水果，少数落后地区亦作为主食。我国香蕉总产量位居世界前三（刘海清和方佳，2010）。由于绝大多数香蕉品种具有不育性和多倍性，很难通过传统的杂交育种方式进行品种改良，因此转基因技术是香蕉育种的有效手段。2012年，人类完成了小果野蕉（Musa acuminata）的全基因组测序工作，绘制了523 Mb的基因组图谱，并从中预测出36549个基因（DHont et al.，2012），为研究香蕉基因表达和密码子使用特点打下了基础。密码子是遗传信息从碱基序列到氨基酸序列传递的基本单位，是连接DNA和蛋白质的桥梁。编码同一种氨基酸的所有密码子称为同义密码子，因此密码子具有简并性，但编码不同生物蛋白质时简并密码子的使用也有一定规律性，称为密码子的使用偏好性（CUB），其中被优先使用的密码子称为最优密码子（Marashi and Najafabadi，2004）。根据密码子偏好性，对目的基因的密码子进行优化，使尽可能多的最优密码子参与外源基因的表达，也使转基因技术更易被操控，对利用转基因技术进行香蕉品种改良具有重要意义。【前人研究进展】近年来，通过优化密码子以提高外源基因在宿主细胞中表达水平的研究报道较多（Soohyun et al.，2012；Stephen et al.，2013；Zelasko et al.，2013；李丽莎等，2016），如通过密码子优化可提高苏云金芽胞杆菌（Bt）cry1Ah基因在转基因玉米（李圣彦等，2011；余桂容等，2015）和转基因水稻（周宗梁等，2012）中的表达量，也可提高蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1在毕赤酵母（杨金玲等，2012）中的表达量。上述研究结果表明，从宿主细胞对密码子使用偏好性入手，通过使用最优密码子的方法可明显提高转基因的成功率。【本研究切入点】目前，香蕉品种选育已成为世界性的难题，虽然香蕉的遗传转化体系已成功建立（May et al.，1995；Acereto-Escoffié et al.，2005；吴静等，2007；Maziah et al.，2007；Tripathi et al.，2008），但转化率低且受品种基因型限制等问题仍未解决（Huang et al.，2007），鲜见有关香蕉密码子使用偏好性的文献报道。【拟解决的关键问题】以香蕉基因组的36242个高置信蛋白基因编码信息为研究对象，分析其密码子的使用情况，明确香蕉对密码子的使用偏好性，以期通过密码子优化提高外源基因尤其是抗病基因在香蕉中的表达水平，为香蕉转基因抗病育种和品质改良提供参考。

1 材料与方法

1. 1 数据来源

从香蕉基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/

content/download-dh-pahang）下载获得高置信蛋白基因CDS序列。为最大程度降低取样误差，编写Java程序并利用其筛选出碱基总数是3的整数倍且转录合成的mRNA含起始密码子和终止密码子的CDS序列。

1. 2 密码子组成和偏好性分析

利用CondonW 1.4.4（http：//codonw.sourceforge.net/）统计分析香蕉基因组密码子的使用情况；对密码子进行整体评价，主要包括同义密码子第3位上4种碱基的出现频率（A3s、G3s、C3s、T3s）、全基因组的GC含量，芳香族氨基酸比例（Aro）等；采用同义密码子的相对使用度（RSCU）、密码子适应指数（CAI）和有效密码子数（ENC）3个指标对密码子偏好性进行评价，其中RSCU和CAI的计算参照Sharp和Li（1987）的方法，ENC的计算参照Wright（1990）的方法。

1. 3 最优密码子确定

采用高表达优越密码子分析法（Stenico et al.，1994）确定最优密码子，具体操作为：首先计算所有基因的ENC和RSCU，并对其进行排序，取前1764个（5%）和后1764个（5%）基因数据，组成高表达组和低表达组。比较两个组的RSCU，当二者的RSCU差值>

0.3，且在高表达组中RSCU>1，在低表达组中RSCU<1，可确定该密码子为最优密码子（Duret and Mouchiroud，1999），并计算最优密码子数目与总密码子数目之比，即为最优密码子使用频率（FOP）。最后，利用SPSS 18.0绘制ENC和GC3s之间的关系图，并对密码子组成与偏好性相关参数进行相关性分析及差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 香蕉基因组的密码子组成分析

从下载的原始数据中筛选获得36242个高置信蛋白编码基因CDS序列，平均长度为1035 bp。分析结果（表1）显示，CDS序列的GC含量为3.0%～75.8%，其中低于20.0%的仅13个序列，全基因组的GC含量为50.4%；同义密码子第3位出现G或C的频率为52.9%，比出现A或T的频率高。同时，对密码子第3位的碱基类型进行统计分析，结果显示，C和G的出现频率分别是33.6%和32.9%，而T和A的出现频率分别为31.5%和26.2%。

2. 2 密码子偏好性分析结果

对密码子偏好性的评价有多个指标，不同评价指标的计算方法及侧重点各有不同。其中，ENC反映了基因编码时对密码子的选择性强弱，其值介于20.0～ 61.0，ENC越小则基因表达对密码子的使用偏好性越强（Wright，1990；Gupta et al.，2004）。当ENC=20.0时表明一种氨基酸只使用某一个特定的密码子；当ENC= 61.0时则表明基因对密码子的选择性不强，可将ENC= 35.0作为密码子偏好性强弱的分界点（Wright，1990；Jiang et al.，2008）。本研究分析发现，香蕉基因组的ENC为20.0～61.0，在36242个高置信蛋白基因CDS中，有632个序列的ENC为20.0～35.0，约占总数的6.5%，有9070个序列的ENC为36.0～61.0，占总数的95.5%，仅有127个序列的ENC为61.0，占总数的1.3%。综上所述，香蕉对密码子的使用有偏好性，部分基因对密码子的使用具有很强的选择性，也有部分基因对密码子无偏好性；基因组的平均ENC为50.7，方差为7.1，表明大多数蛋白编码基因的密码子使用偏好性较弱。

利用CodonW 1.4.4对36242个高置信蛋白基因进行分析，并以.blk的文件形式保存便于后续RSCU的计算。RSCU是同义密码子实际使用数目和使用期望均值间的比值（Sharp et al.，1986；Liu et al.，2004），直接反映密码子使用偏性。当RSCU=1时，表示密码子使用是随机的，无明显的偏好性，当RSCU>1或RSCU<1，则表示某个密码子的使用频率相对于其他同义密码子更高或更低，存在使用偏好性（Sau et al.，2006）。香蕉基因组对所有氨基酸同义密码子的偏好性、使用频率等统计结果如表2所示。RSCU值>1且第3位为A、T、C和G的密码子数目分别占RSCU>1密码子总数的18.7%、11.4%、39.1%和30.8%，其中第3位为C的密码子数目最多，第3位为T的密码子数目最少，表明香蕉基因编码时偏好使用以C结尾的密码子，较少使用以T结尾的密码子。

CAI是指编码区同义密码子和密码子最佳的使用匹配程度，其值介于0～1，且与基因表达水平相一致（Gupta et al.，2004）。不同长度香蕉基因的ENC、GC3s和CAI 3个参数值如表3所示，基因的长度或数目和ENC存在正相关，因此，基因编码区越长在编码时随机利用密码子的概率越高。此外，CAI和GC3s也存在明显的正相关，且当基因编码区长度（L）为400～600 bp时，CAI和GC3s最大，表明在此长度范围的基因表达量最大，且偏好使用以G或C结尾的密码子。

3 讨论

随着物种进化和环境改变，为了更好地适应生存环境，各种生物不断完善其自身的基因表达过程，致使同义密码子的偏好性因物种而异，与自身的基因特征密切相关。因此，当外源基因转入到生物體内，其表达过程受密码子偏好性的影响，易发生甲基化，可能引起外源基因沉默或基因表达水平过低（Perlak et al.，1990）。而当外源基因同生物体自身基因对密码子的使用偏好性相似时，外源基因更易表达。

本研究对香蕉密码子的使用偏好性进行了分析，结果显示，随基因编码区长度的增加，密码子的使用偏好性逐渐降低，与水稻（刘庆坡，2005）、大豆（张乐等，2011）和葡萄（续晨等，2012）等作物基因组密码子的使用偏好性一致，但与大肠杆菌基因组密码子的使用偏好性相反，即基因越长密码子的使用偏好性越大（侯卓成和杨宁，2002）。Moriyama和Poeell（1998）研究发现，在自然选择的压力下缩短表达量高的基因长度对生物体有利，其原因是较长的基因表达时需要消耗较多的能量。由此推测，基因编码区长度与密码子使用偏好性的相关性与进化地位有关。此外，本研究发现以G或C结尾的密码子使用频率最高，且在17个最优密码子中，以G或C结尾的最多（15个），表明香蕉基因组偏好使用G或C结尾的密码子，与大豆（张乐等，2011）、葡萄（续晨等，2012）、草菇（蒋玮等，2014）和赤芝（朱孝轩等，2014）等基因组密码子的偏好性一致。由ENC和GC3s的散点图可知，虽然大部分基因符合期望曲线，但也有部分基因偏离该曲线，间接表明除了核苷酸组成外，基因突变和自然选择等因素也会影响基因表达对密码子的偏好性选择，而拟南芥的密码子偏好主要受自然选择的影响（Chiapello et al.，1998）。

4 结论

香蕉基因组中多数基因的密码子使用偏好性较弱，但少部分基因具有强偏好性，偏好使用以G或C结尾的密码子，且偏好性受到核苷酸组成、基因突变及自然选择等因素的影响。

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（責任编辑 陈 燕）