苦玄参育种材料遗传多样性SSR分析

谢阳姣　李耀燕　闫国跃　何志鹏　白燕远

摘要：【目的】探索苦玄參育种材料的遗传多样性及亲缘关系，为苦玄参育种资源的选择及遗传改良提供参考依据。【方法】利用SSR分子标记，分析12份苦玄参育种材料的基因多样性指数（Nei）、Shannon多态性信息指数（I）、多态性百分率（P）及各材料间的遗传距离，并基于遗传距离对其进行聚类分析，以明确该育种材料的遗传多样性和亲缘关系。【结果】17对SSR引物共扩增出73个等位基因，平均每对引物4.3个。各引物间P变化范围为8.33%～100.00%，平均60.78%；多态信息量（PIC）变化范围为0.0767～0.7598，平均0.5184。供试材料遗传多样性的平均Nei=0.3002、I=

0.4162、P=59.81%，其中xyj01、xyj06和ytL09种质Nei、I和P最高，分别为0.3529、0.4893和70.59%；Lxj12种质Nei、I和P最低，分别为0.2059、0.2854及41.18%。ytl09和zgb03 2份种质间遗传距离最近，仅0.0929。基于遗传距离的聚类分析结果表明，在遗传距离0.4084处可将12份种质分成4个群体，其中wzhjx07、lxj09和xyj01自成一群，其余归为一群。Lxj12与zgb04、ytl11与wzhjx09、ytl09与zgb03、wzhjx12与xyj06和wzhzp22间分别拥有较近的亲缘关系。【结论】供试12份苦玄参种质材料间存在一定的遗传差异，作为育种亲本具有一定的选择价值。

关键词： 苦玄参；SSR；遗传多样性

中图分类号： S567.53 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0020-06

Abstract：【Objective】The objective of this research was to explore genetic diversity and genetic relationship of Picria felterrae Lour. breeding materials and to provide reference for breeding materials selection and genetic improvement. 【Method】Using SSR molecular marker， gene diversity index（Nei），shannon diversity information index（I），percentage of polymorphic loci（P） and genetic distance of 12 breeding materials P. felterrae Lour.were analyzed. And cluster analysis was conducted based on genetic distance to study the genetic diversity and genetic relationship of the 12 breeding materials. 【Result】A total of 73 alleles were amplified from 17 pairs of SSR primers，4.3 alleles per primer. Among the primers， P varied between 8.33%-100.00%，with an average of 60.78%； polymorphic information content（PIC） varied between 0.0767-0.7598 which was 0.5184 on average. For the 12 germplasm samples tested，the average level of genetic diversity was Nei=0.3002，I=0.4162，and P=59.81%. Number xyj01， xyj06 and ytL09 had the highest Nei which was 0.3529， the highest I 0.4893 and the highest P 70.59%. Whereas Lxj12 had the lowest level in Nei which was 0.2059，the lowest I 0.2854 and the lowest P 41.18%. Number ytl09 and zgb03 had the shortest genetic distance， which was 0.0929. The cluster analysis based on genetic distance revealed that the 12 germplasm samples could be divided into four groups at the location where genetic distance was 0.4084. Number wzhjx07，lxj09，and xyj01 made up three groups by themselves， and the rest was in the last group. There were close genetic relationships between Lxj12 and zgb04，between ytl11 and wzhjx09，between ytl09 and zgb03，between wzhjx12 and xyj06， wzhzp22. 【Conclusion】Certain genetic difference exists in the 12 tested Picria felterrae Lour. breeding materials，which are valuable in terms of selection of parents in breeding.

Key words： Picria felterrae Lour.； SSR； genetic diversity

0 引言

【研究意义】苦玄参（Picria felterrae Lour.）是收录于中国药典的一种药用植物（国家药典委员会，2015），是广西道地药材，在广西作为药用已有200多年的历史（蒋妮等，2013）。苦玄参自20世纪50年代由分布于龙州的野生种质被驯化以来，随后引种至梧州等地，成为梧州及龙州部分地区重要的经济作物之一。目前，苦玄参栽培种质未经品种纯化，且经过多年人工种植后种质优势发生退化，导致药材质量下降。因此，科学选择优良种质，对苦玄参品种进行纯化和改良非常必要。作物育种的本质是聚集更多优良基因，从基因水平研究苦玄参种质差异可为苦玄参良种选育和遗传改良提供依据。【前人研究进展】传统育种主要依赖于对植物表型性状进行选择，选择效率较低。分子标记辅助育种利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测相连锁的分子标记达到选择目标性状的目的，相较于表型选择具有快速、准確等优点，因此成为作物育种研究的热点。常用DNA分子标记中的简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）在原核生物和真核生物基因组中随机分布，且该标记呈共显性，符合孟德尔遗传定律，易于操作，具有高度重复性和可靠性，显示出较强的多态性等优点，使其在作物遗传育种方面得到广泛应用，成为分子标记辅助育种的重要分子标记之一（陈怀琼等，2009）。王娟等（2013）利用SSR分子标记，辅助选择了棉花育性恢复基因Rf1；吴斌等（2014）利用SSR连锁群图谱，定位了4个控制β-葡聚糖含量的QTL位点。在遗传多样性分析方面，陈娇等（2013）应用SSR分子标记对樱桃野生居群的多样性进行分析，明确了不同居群的遗传分化水平；倪先林等（2015）为了阐明糯高粱种质资源之间的亲缘关系，用25对SSR引物评价29份糯高粱种质资源，结果表明，29份糯高粱品种的亲缘关系与地理来源关系不明显，其种质资源具有较丰富的遗传多样性；南文卓等（2016）利用SSR分子标记对30份甘薯种质资源进行遗传多样性分析，明确了其在DNA分子水平上的遗传差异；张恩慧等（2016）利用SSR分子标记对97份广西有代表性的普通油茶种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，已开发的油茶SSR分子标记适用于广西普通油茶，广西普通油茶种质资源拥有较丰富的遗传多样性。【本研究切入点】目前，关于苦玄参的研究主要集中在化学成分、药理药效及人工种植技术方面（王力生，2004；王奇志等，2010；陈君等，2013；蒋妮等，2013），而与其分子遗传基础相关的研究较少。本课题组前期试验选择出的苦玄参育种材料的分子遗传基础也有待明确。【拟解决的关键问题】利用SSR分子标记分析本课题组前期选择的苦玄参育种材料的遗传差异及亲缘关系，为其育种资源的选择及遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验材料采于苦玄参主产区广西龙州和梧州，根据苦玄参苷IA、苦玄参苷IB、花色、茎节、分枝数、茎色、叶脉、叶缘和叶基等表型性状差异筛选出12份育种亲本。12份种质的形态学性状及苦玄参苷含量见表1。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 材料处理 供试材料种子于2015年在广西南宁统一种植，2月底播种，4月底移植，温室水培。水培装置为定制的方形水管，内径20 cm，长度110 cm，孔径8 cm，每个培养箱22个孔径（每孔2株，共44株），每份种质种植5个水培箱，合计220株。用于预试验的Lxj12和zgb04种植数量翻倍。水培液为改良的霍格兰氏营养液，每10 d更换1次；水泵驱动水循环解决供氧问题。7月统一取样，取样时取主茎倒数第2对真叶，置于20倍数量的硅胶瓶中迅速干燥后，置于-20 ℃冰箱保存，用于提取总DNA。

1. 2. 2 预试验 由于取样数量过大将增加试验成本，取样数量过小则影响试验结果，本研究参考孙峰成等（2013）的方法，以编号为Lxj12和zgb04的2份材料为预试验材料，分别从其中选取60个单株用于取样数量和方法的预试验。其中，样本分为单株提取DNA、15和30个单株叶片分别混合提取DNA及单株提取DNA后15和30个单株的DNA分别等量混合，即每份材料共72个DNA样本。提取方法编码见表2。

1. 2. 3 正式试验取样和DNA提取 正式试验根据预试验结果，每份种质取60个单株，分成2组，每30个单株提取DNA后，等量混合用于PCR扩增。DNA采用CTAB法提取，提取产物取2～3 μL用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，其余置于-20 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 4 PCR扩增 PCR反应体系20.0 μL：ddH2O 14.8 μL，dNTP 0.4 μL，Buffer 2.0 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，DNA模板2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃35 s，72 ℃ 40 s，进行35个循环；最终72 ℃延伸3 min。引物为本课题组采用磁珠富集法开发，从开发的100对引物中筛选出具有多态性的引物17对，具体信息及NCBI登录号见表3（X-P34由于所在序列太短，不能上传序列至NCBI）。

1. 2. 5 变性电泳 选择扩增PCR产物加上样缓冲液，94 ℃变性10 min后于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。

1. 3 数据分析

用POPGENE 32.0计算以下参数：（1）多态位点百分率（P）；（2）平均多态信息量（PIC）；（3）基因多样性指数（Nei）。并基于遗传距离，采用UPGMA法对各种群进行聚类分析，构建聚类分析图。

2 结果与分析

2. 1 预试验结果

以编号为Lxj12和zgb04的种质为预试验材料，以单株DNA、叶片混合样品提取DNA及单株DNA混合为样本，以等位基因数为评价指标，分析不同取样方式的差异，结果见表4和表5。由表4和表5可知，Lxj12种质经5种取样方式获得的等位基因数相同；zgb04种质除30个单株叶片混合后提取DNA的引物X-P18少扩增1个等位基因外，其余引物扩增等位基因数均相等。由此可知，5种取样方法中除30个单株叶片混合提取DNA与单株提取DNA的样本间可能存在差异外，其余几种方式均与单株提取DNA无差异。可能是本研究所选择的材料均来自单株，由于苦玄参为自花授粉植物，经多年种植后，材料趋于稳定，因此单株后代分离较小，等位基因数较稳定，混合DNA样本基本能代表单株DNA样本进行等位基因分析。鉴于多个单株叶片混合样本可能存在等位基因扩增不完全的现象，而单株样本试验过于复杂，因此采用30个单株提取DNA后等量混合进行后续研究。

2. 2 遗传多样性分析结果

由表6可知，在17對SSR引物中，引物X-P30在hjx07种质中未扩增出有效产物，其余均能扩增出稳定清晰可辩的产物。其中，17对SSR引物共扩增出73个等位基因，每对引物可扩增出2～8个等位基因，平均每个引物可扩增等位基因4.3个。总位点204个，扩增位点203个，其中多态位点124个，每对SSR引物的多态位点1～12个，平均7.3个。各引物间多态位点百分率（P）变化范围较大（8.33%～100.00%），平均为60.78%，多态百分比较高。各SSR引物多态信息量（PIC）变化范围为0.0767～0.7598，平均值0.5184。

由表7可知，供试材料不同种质间的Neis基因多样性指数（Nei）、Shannon多态性信息指数（I）及P均具有明显差异，Nei变化范围在0.2059～0.3529，平均0.3002；I变化范围为0.2854～0.4893，平均0.4162；P变化范围为41.18%～70.59%，平均59.81%。以上3个指标最高的是xyj01、xyj06和ytL09种质，最低的是Lxj12种质，说明xyj01、xyj06和ytL09具有较高的遗传变异，Lxj12变异较小。由此可知，选出的12份种质间存在一定程度的遗传分化。

2. 3 各种质间亲缘关系

由表8中各种质的遗传相似系数和遗传距离可知，12份育种材料的相似系数和遗传距离分布范围较广，相似系数为0.4286～0.9113，遗传距离为0.0929～ 0.8472。其中，ytl09和zgb03种质相似系数最高，为0.9113；遗传距离最小，仅0.0929，表明其亲缘关系最近；ytl11和wzhjx07种质相似系数最小，为0.4286；遗传距离最大，为0.8472，表明其亲缘关系较远。依据遗传距离进行聚类分析（图1），结果发现在遗传距离0.5136处，可将12份种质分为两大群体，其中类群1包括wzhjx07和lxj09 2个种质，其余种质归入另一类群（Ⅱ）。在遗传距离0.4084处，可将12份种质分成4个群体，其中wzhjx07、lxj09和xyj01自成一群，其余归为一群，表明这3个种质与其他种质的亲缘关系较远，其他种质来源亲缘关系较近。Lxj12与zgb04、ytl11与wzhjx09、ytl09与zgb03、wzhjx12与xyj06和wzhzp22间各自拥有较近的亲缘关系。

3 讨论

3. 1 苦玄参育种材料的遗传多样性

苦玄参为广西道地药材，由于野生资源的缺乏，其药材来源以人工种植为主。但苦玄参人工种植品种不纯，质量不一，急需对其栽培种质进行遗传改良和品种纯化。种质资源是育种工作的基础，而植物遗传多样性研究与种质资源评价和鉴定是种质资源研究的重要内容。本研究基于SSR分子标记，对本课题组前期选择的12份育种材料进行遗传多样性分析，发现12份种质的基因多样性指数、多态性信息指数及多态位点百分率均具有一定差异，12份种质间存在一定程度的遗传分化，作为育种亲本具有选择意义。苦玄参为自花授粉植物，经多代自交后种质趋于纯合，品种经纯化后理论上较难分离。但由于苦玄参栽培种质为20世纪50年代由野生种质驯化而来，未经品种纯化，且经多年种植后出现变异，可能是其种质发生分化的根本原因。

苦玄参分布于我国南部、西南部及越南、印度等热带亚热带地区（李玲和金李峰，2016），分布区的气候和土壤具有一定差异，种质变异明显，遗传基础丰富。本研究仅对本课题组前期选择育种群体的遗传多样性进行分析，选材具有一定局限性。为丰富苦玄参遗传改良资源，下一步有必要对其自然分布区的野生资源进行评价及鉴定，以收集更多育种材料，为苦玄参遗传改良提供更多资源。

3. 2 基于SSR分子标记育种材料间的亲缘关系

种质资源亲缘关系的分析是建立育种群体的基础。一般来说，亲缘关系越远，遗传距离越大，其性状变异越大，育种资源越丰富（胡标林等，2012）。分析苦玄参育种亲本间的亲缘关系，对苦玄参育种群体的建立和亲本的选择具有重要意义。本研究基于SSR遗传距离对所选的12份育种材料进行聚类分析，可知12份种质的遗传距离分布范围较广，其中wzhjx07、lxj09和xyj01与其他种质间遗传距离较远，分化较大，可能在种植过程中受各种因素的影响产生了明显变异；另有2份品质较高的种质Lxj12和zgb04遗传距离较近。该结果可为育种亲本的筛选提供基础。

本研究中SSR分子标记引物采用磁珠富集法获得，由于该法较复杂且费用较高，因此开发的引物数量有限。本研究仅应用17对具有多态性的引物进行SSR多态性分析，分析结果可能受到一定影响。现今高通量测序已成为常规分子分析手段，采用转录组测序开发SSR分子多态性标记更有前景，可成为今后苦玄参遗传基础研究的方向。

4 结论

本研究结果表明，12份苦玄参育种材料的基因多样性指数、Shannon多态性信息指数及多态性百分率均具有明显差异；各种质间遗传距离分布范围较广，在遗传距离0.4084处可将12份种质分成4个群体，其中wzhjx07、lxj09和xyj01自成一群，其余归为一群。12份材料间遗传分化明显，作为育种亲本具有一定的选择价值。

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（责任编辑 王 晖）