蓝亚麻花瓣中类黄酮化合物及代谢途径分析

宋洋　雷霆　金雪花　付灯祥

摘要： 花色是观赏植物重要的观赏性状之一，而类黄酮是其主要的呈色物质。该研究以蓝亚麻花瓣为研究对象，将蓝亚麻开花过程分为5个阶段，并用高效液相色谱—光电二极管阵列检测技术（HPLCPAD）和高效液相色谱—电喷雾离子化—质谱连用技术（HPLCESIMS）分析不同开花阶段花瓣中类黄酮化合物的成分和含量。结果表明：蓝亚麻花瓣中积累飞燕草素苷、矢车菊素苷和锦葵素苷，未检测到天竺葵素苷，其中以酰基化的飞燕草素苷为主要呈色物质；而总花青素苷含量在第2阶段达到最高。根据花青素苷终产物和类黄酮中间代谢产物推定了蓝亚麻花瓣中类黄酮代谢途径，其中以F3′5′H所引导的分支途径占优势，其主要原因可能是F3′5′H酶活高于F3′H。

关键词： 蓝亚麻， 花青素苷， 类黄酮， 花色， 代谢途径

中图分类号： Q946.8

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）11136810

Abstract： Flower colour is one of the most ornamental quality in ornamental plant， and flavonoid is the main pigment. In this study， the flowering stages of Linum pernne was divided into five stages. We used high performance liquid chromatography with a photodiode array detector（HPLCPAD） and HPLCelectrospray ionizationmass spectrometry（HPLCESIMS） method for qualitative and quantitative analyses of anthocyanins and the key flavonoid intermediate product in the different flower development stages. The results were as follows： L. pernne petals contained delphinidin， cyanidin and malvidin， but pelargonidin was no detected， and the main color substance was acylation of delphinidin； The highest total contents of the anthocyanins was at Stage 2. According to the end product and the intermediate product， we speculate the flavonoid biosynthesis pathways in L. pernne， in which F3′5′H leading branch pathway is dominant， and the main reason for that is F3′5′H enzyme activity is higher than that of F3′H.

Key words： Linum pernne， anthocyanin， flavonoid， flower colour， biosynthesis pathways

花色是观赏植物重要的观赏性状，决定花色的色素成分分为三类：类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素。其中，类黄酮中的花青素苷可使花色呈现橙黄、红色到紫色和蓝色，而黄酮和黄酮醇使花色呈黄色至白色。不同物种合成有限的类黄酮物质，使花瓣呈现有限的颜色。菊花、玫瑰、香石竹、百合等因不能积累飞燕草素苷所以花瓣不能呈现蓝色（戴思兰和洪艳，2016），而大花蕙兰、矮牵牛等不能积累天竺葵素苷，故不能开出砖红色的花（Johnson et al， 1999；Leonard et al， 2008）。

分析呈色物质，解析呈色物质的代谢途径是研究花色的重要手段。迄今，已在多种植物中通过检测花青素苷的终产物和中间产物，研究花青素苷的代谢途径，解析花色的形成机理。如通过分析不同花色瓜叶菊花瓣中的花青素苷和中间代谢产物（Jin et al，2016）、对蓝色和白色风信子花瓣中类黄酮代谢物质（Lou et al，2014）、对蓝色和紫色六倍利（Lobelia erinus）进行色素物质比较（Hsu et al， 2016）、不同花色耐寒睡莲花瓣花青素苷成分（朱满兰等，2012）以及蓝色睡莲色素物质成分（Wu et al， 2016），研究了观赏植物花瓣中的类黄酮代谢途径，解析其呈色机理。

当前花青素苷分析的重要方法为HPLCMS（液相色谱-质谱联用）法，该方法分析速度快、灵敏度高（De et al，2006），已广泛应用于类黄酮物质的分离和鉴定（Lou et al，2014；Jin et al，2016）。

蓝色花具有独特的观赏性，可形成园林景观中罕见的蓝色色调，因此是花色遗传育种学家研究的重要材料。蓝亚麻（Linum pernne）又名亚麻花，是亚麻科，亚麻属二年生草本花卉，株高60～70 cm，花呈素雅的蓝色，是为數不多的蓝色地被植物，是目前国际流行的组合盆栽花材，也是研究蓝色花形成机理的好材料。而目前对蓝亚麻的研究仅限于栽培和园林应用（孙慧杰等，2009；叶剑秋等，2007；张明丽等，2006），未见对其花色呈色物质的研究报告。

本研究以蓝亚麻花瓣为研究对象，分析蓝亚麻花瓣中花青素苷、黄酮和黄酮醇的成分和含量，以及花青素苷在不同开花阶段花瓣中的变化规律，推定类黄酮的代谢途径，为探讨蓝亚麻蓝色花呈色机理、为蓝色花遗传育种提供参考。

1材料与方法

1.1 植物材料

以蓝亚麻为植物材料，采自昆明理工大学实验田，选择花色一致、长势均一的花瓣，采集不同开花阶段的花瓣进行呈色物质的分析。按形态特征，将蓝亚麻开花过程分为5个阶段（表1）。

1.2 黄酮、黄酮醇和花青素苷的提取

摘取5个开花阶段的蓝亚麻花瓣，用液氮研磨至粉末状。液氮挥发后，用花青苷提取液：甲醇∶水∶甲酸∶三氟醋酸=70∶27∶2∶1提取，每250 mg鲜重加1 mL提取液。黄酮和黄酮醇的样品处理方法与花青素苷相同，提取液为甲醇，每100 mg鲜重加1 mL甲醇提取。将两种提取液均置于4 ℃处放置，浸提24 h，每隔12 h震荡一次（Yoshitama，1981； Jia et al，2008）、（张剑亮等，2009），提取液经0.2 μm的过滤器过滤，得到待测样品。

1.3 花青素苷、黄酮和黄酮醇含量测定

采用高效液相色谱法（HPLCPAD）来分析蓝亚麻花青素苷、代谢途径的中间产物（黄酮和黄酮醇）的含量（李崇晖等，2008）。花青素苷测定仪器使用Agilent高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent公司的ZORBAX型SBAq （4.6 mm × 250 mm）。HPLC测定条件：检测波长530 nm，流动相为A、B两相。A相为水∶甲酸∶三氟醋酸= 97.9∶2∶0.1；B相为水∶乙腈∶甲酸∶三氟醋酸= 62. 9∶35∶2∶0.1。进样量为10 μL，柱温25 ℃，流速0.8 mL·min1。流动相B的洗脱梯度为0～20 min，30%～53%；20～40 min，53%～53%；40～45 min，53%～30%；45～50 min，30%～30%。配制不同浓度的为氯化矢车菊素（Cyanidin），根据浓度和峰面积绘制标准曲线，计算花青素苷含量。

黄酮和黄酮醇的测定使用戴安公司生产的高效液相色谱仪（Ultimate 3000API 3200 Q TRAP）。色谱柱型号为MSLab HPC18（150*4.6 mm 5 μm）， HPLC测定条件：流动相为A（水）、B（乙腈）两相。进样量为10 μL，柱温50 ℃，流速1 mL·min1。流动相B的洗脱梯度为0～1.5 min，90%；1.5～7 min，70%；7～8 min，40%；8～10 min，5%；10～15 min，90%。配制不同浓度的标准品，根据浓度和峰面积绘制标准曲线，计算黄酮和黄酮醇含量。

采用高效液质谱联用仪（HPLCESIMS）分析样本的花青素苷成分。高效液质联用法分析条件：采用Agilent 6540QTOT液质联用仪进行HPLCESIMS分析。液相色谱的分析条件与上文相同。质谱分析条件：ESI正离子扫描，扫描范围（m/z）：100～1 600；干燥气为氮气，干燥温度350 ℃，流速6.0 L·min1，毛细管电压3 500 V，喷雾器压力200 kPa，毛细管出口电压100 V。用MZmine软件分析质谱结果。

本研究所用标准品为氯化矢车菊素（Cyanidin）、柚皮素（Naringenin）、芹菜色素（Apigenin）、木犀草素（Luteolin）、二氢杨梅素（Dihydromyricetin）、二氫山奈酚（Dihydrokaempferol）、二氢槲皮素（Dihydroquercetin）、杨梅素（Myricetin）、山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercetin），均购于上海源叶生物科技有限公司。

2结果与分析

2.1 不同开花阶段蓝亚麻花瓣中花青素苷组成的特征

采用高效液相色谱法分析蓝亚麻花瓣花青素苷的含量，在检测波长530 nm处出现4个峰（图1），按保留时间顺序分别定义为A1、A2、A3、A4。花青素苷的紫外光谱吸收峰表明，A1～A4均在紫外光区有两个吸收峰，可见光区有一个吸收峰（图2）。经过酰基化修饰的花青素苷在紫外光区有2个吸收峰，可见光区485～550 nm之间有1个吸收峰（安田奇，1989）。

花青素苷的质谱中分子离子常带一个氢离子，以 [M+H]+的形式存在，花青素苷的类型依据质谱中苷元离子 [Y0]+质荷比推定（Beatriz et al，2009； Stobiecki，2000； Cuyckens & Claeys， 2004）。

本研究对4种花青素苷进行质谱分析，花青素苷的类型可根据质谱图中的花青素苷碎片特征推定（图3，表2，表3）。从4个质谱图中推定各花青素苷的碎片离子，花青素苷A1，经过一级质谱得到分子离子773（[M+H]+），释放出飞燕草苷元（[Y0]+）特征碎片离子m/z 303（[Y0]+），释放出碎片离子m/z 470（[Glu+Caf+Glu] +）为分子离子减去2个葡萄糖和1个咖啡酰基的结果。花青素苷A2，经过一级质谱得到分子离子757（[M+H]+），释放出飞燕草苷元（[Y0]+）特征碎片离子m/z 303（[Y0]+），释放出碎片离子m/z 454（[Rha+Cou+Glu] +）为分子离子减去1个鼠李糖、1个香豆酰基和1个葡萄糖的结果。花青素苷A3，经过一级质谱得到分子离子757（[M+H]+），释放出矢车菊苷元（[Y0]+）特征碎片离子m/z 287（[Y0]+），释放出碎片离子m/z 470（[Glu+Caf+Rha]+）为分子离子减去1个葡萄糖、1个咖啡酰基和1个鼠李糖的结果。花青素苷A4，经过一级质谱得到分子离子669（[M+H]+），释放出锦葵素苷元（[Y0]+）特征碎片离子m/z 331（[Y0]+），释放出碎片离子m/z 338（[Glu+Fer]+）为分子离子减去1个葡萄糖和1个阿魏酰基的结果。综上所述，A1、A2为飞燕草素苷，A3为矢车菊素苷，A4为锦葵素苷。

2.2 蓝亚麻不同开花阶段花瓣中花青素苷含量及变化规律

对5个开花阶段蓝亚麻花瓣中花青素苷进行定量分析（表4），得知A1、A2含量除第一阶段外，均占总花青素苷含量在60%以上，即飞燕草素苷在花朵开放过程中为主要的呈色物质。

对蓝亚麻花青素苷A1、A2、A3、A4含量在花朵开放过程中的变化来看，A1、A2、A3在第2阶段含量最高，其他4个阶段无显著差异。而A4含量在第1阶段最高，然后呈现逐渐下降趋势。各花青素苷合成高峰均在早期。

2.3 蓝亚麻黄酮和黄酮醇组成

为了进一步解析蓝亚麻花色呈色物质基础，解析其花瓣片中类黄酮的代谢途径，本研究对处于花朵开放第5阶段的花瓣片，进行关键中间代谢产物的检测（表5）。结果三种二氢黄酮醇均检测到，其中二氢槲皮素含量最高，然后是二氢山奈酚，二氢杨梅素最少。同时检测到杨梅素和山奈酚，但未检测到槲皮素。

3讨论

3.1 蓝亚麻花瓣呈色物质种类及其含量的动态变化

决定花色的主要色素物质为花青素苷，花青素苷主要合成于细胞质，积累于液泡中，使花色呈现橙、粉、红、紫和蓝色。其中天竺葵素苷使花色呈现红色到砖红色，矢车菊素苷使花色呈现红色、深红色，而飞燕草素苷可使花色呈现蓝色，锦葵素苷使花瓣呈现蓝紫色（Tanaka et al，2008）。

本研究在蓝亚麻花瓣中检测到4种花青素苷：飞燕草素苷（A1和A2）、矢车菊素苷（A3）以及锦葵素苷（A4）。其中飞燕草素苷含量除第1阶段外，其余阶段均占花青素苷总量的60%以上。同时发现这些花青素苷都得到了芳香酰基化修饰。因此，认为芳香酰基化飞燕草素苷是蓝亚麻花瓣呈蓝色的主要原因。智利蓝番红花（Tecophilaea cyanocrocus）和蓝色银莲花（Anemone coronaria）中，使其呈蓝色的呈色物质也为酰基化飞燕草素苷（Mori et al，2014；Saito et al，2002）。酰基化（Acylation）是花青素苷重要的修饰方式之一，其中芳香酰基化修饰，可使最大吸收波长蓝移有效产生蓝色的同时，通过分子间的堆叠使蓝色更稳定（Honda & Saito，2002；Luo et al，2007；Sasaki & Nakayama， 2015）。

在蓝亚麻中花青素苷的积累，前2个阶段最高，即在未完全开放前达到最高值，之后花青素苷含量下降，这可能是因为开花过程中花瓣面积的增加速度大于花青素苷合成的速度。也有人认为随着花瓣的展开，受光的面积增大，光照引起花青素苷的降解或氧化，引起花青素苷含量的降低（张玲等，2015）。也有些植物为了防止紫外线对细胞的毒害，在完全开放前就完成了花青素苷的合成，草原龙胆就有类似的现象（Uddin et al，2002）。

3.2 蓝亚麻类黄酮合成途径竞争关系

我们根据终产物花青素苷和中间产物黄酮、黄酮醇，推定了类黄酮的代谢途径（图4），即在蓝亚麻花瓣中，类黄酮合成途径，在柚皮素处，由F3′H、F3H和F3′5′H催化发生了三个分支，分别生成圣草酚、二氢山奈酚（DHK）和五羟黄酮。圣草酚在F3H和FNS的作用下分别生成二氢槲皮素（DHQ）和木犀草素。DHK在F3′H、FLS和F3′5′H作用下分别生成DHQ、山奈酚和二氢杨梅素（DHM）。DHQ接着在DFR、ANS、GT、AT的催化下生成了酰基化的矢车菊素苷。而DHM一部分在FLS的作用下生成楊梅素，一部分在DFR、ANS催化下生成了飞燕草素。而飞燕草素分为两个分支，一个是甲基化合成锦葵素，锦葵素在GT、AT作用下进一步生成酰基化锦葵素苷；而大部分飞燕草素在GT、AT作用下生成2种酰基化飞燕草素苷。从而最终生成4种花青素苷。

F3′5′H所引导的分支产物飞燕草素苷（A1和A2）和锦葵素苷（A4）含量占花青素苷总量的80.62%，F3′H所引导的分支产物矢车菊苷（A3）仅占19.38%。这说明F3′5′H的酶活远高于F3′H，使代谢流流向飞燕草素分支方向，从而使花色呈蓝色。下一步可以检测两个酶所编码的基因转录表达水平及酶活，进行比较鉴定，并分析F3′5′H基因序列。F3′5′H和F3′H决定飞燕草素和矢车菊素的分支流（戴思兰和洪艳，2016）， 在瓜叶菊中F3′5′H与F3′H表达量的比率决定了DHK处的代谢流走向（Jin et al，2016），在枸杞中，F3′H和F3′5′H的酶活特性决定产生矢车菊素或飞燕草素代谢流（Zeng et al，2014）。

在蓝亚麻花瓣中我们并未检测到天竺葵素苷（表4）。这可能因为F3′H、FLS和F3′5′H活性高于DFR，且其DFR可能具有底物特异性，所以二氢山奈酚（DHK）没有进一步被DFR催化生成无色天竺葵素，也就不能生成天竺葵素苷。前人研究认为抑制F3′5′H和/或F3′H基因的表达可改变花青素的分支途径合成天竺葵素（Tanaka & Brugliera， 2013）。在烟草（Forkjrnan & Ruhnau， 1987）、大花蕙兰、大花牵牛等植物中由于DFR具有底物特异性，不能有效还原DHK，导致天竺葵素的缺乏（Johnson et al，1999；Leonard et al，2008）。另外，阻断花青素的积累会增强黄酮和黄酮醇的代谢流，反过来阻断黄酮和黄酮醇的合成，将会促进花青素苷的积累，如通过下调黄酮醇合成酶（FLS）的表达，阻断黄酮醇的合成，增加了花青素苷合成代谢流（Davies et al，2003），而干扰黄酮合成酶（FNS），阻断黄酮的合成，促使大量花青素苷的积累，如大丽花（Deguchi et al，2013；Deguchi et al，2015）。

综上所述，在蓝亚麻花瓣中不同花青素苷分支途径、黄酮和黄酮醇合成途径之间存在竞争关系。其中，之所以大量积累F3′5′H所诱导的分支产物，可能是因为F3′5′H的酶活远高于F3′H，故蓝亚麻F3′5′H可能是培育蓝色花的有效基因资源。本研究在蓝亚麻花瓣中所检测到的花青素苷均酰基化修饰，故认为蓝亚麻是挖掘酰基修饰基因的有效种质资源。这些结果将为进一步解析蓝亚麻呈色机理提供依据，为花色研究提供方法。

致謝感谢昆明理工大学建筑与城市规划学院的本科生：顾希婧、夏俊红、王阿娟、李瑞林和母其杰5位同学在本研究实验材料处理中给予的帮助。

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