濒危特有种掌叶木的微卫星遗传多样性研究

滕婕华　卫家贤　李象钦　李超群　倪敏　翁乐逸　谢国文

摘要： 掌叶木居群具有较丰富的遗传多样性，该研究利用9对微卫星（SSR）分子标记揭示了掌叶木（Handeliodendron bodinieri）的遗传多样性。结果表明：观测等位基因数（Na）平均为3.903，有效等位基因数（Ne）平均为2.545，期望杂合度（He）平均为0.521，Shannons多态性信息指数（I）为0.962，PIC平均值为0.465。掌叶木的自然分布居群有相对较高的遗传多样性，但由于人为破坏等因素导致该群体濒危，而濒危并不是因为遗传多样性降低而造成的。居群间的遗传分化为掌叶木8个居群间的遗传一致度为（GI=0.849～0.970），遗传距离为（GD=0.032～0.164）。基于Neis遗传距离用UPGMA法对掌叶木居群进行聚类，Neis的基因分化系数为（Gst）为0.027，平均Nei标准遗传分化系数（G′stN）为0.031，平均Hericks标准遗传分化系数（G′stH）为0.064，基因流（Nm）为3.368。AMOVA分析结果表明：掌叶木居群间变异占3%，居群内变异占97%，居群内的遗传分化大于居群间的分化。利用Mantel检测发现，居群间的遗传距离与地理距离显著正相关（r=0.299，P<0.05）。该研究结果为掌叶木生物多样性和资源保护与利用提供了更充分的科学依据。

关键词： 掌叶木， 微卫星（SSR）， 濒危植物， 遗传多样性， 毛细管电泳

中图分类号： Q949.9

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）11147109

Abstract： Genetic diversity of Handeliodendron bodinieri was studied with microsatellite （SSR） markers. We used nine pairs polymorphic microsatellite loci to reveal that H. bodinieri was rich in genetic diversity. Average number of alleles （Na） and effective number of alleles （Ne） were 3.903 and 2.545 respectively. The mean expected heterozygosity （He） was 0.521 and Shannons diversity （I） was 0.962 and PIC=0.465. Natural populations of H. bodinieri had relatively high level of genetic diversity， however the genetic diversity of the populations were reduced due to factors like sabotage. The majority of genetic variation occurred within populations. The genetic distance

（GD） and genetic identity （GI） among eight populations of H. bodinieri were 0.032-0.164， 0.849-0.970， respectively. According to genetic distance UPGMA， genetic differentiation （Gst = 0.027）， G′stN=0.031， G′stH=0.064 and gene flow （Nm） was 3.368. The results analyzed by AMOVA showed that the variation among the populations was 3%， while the variation within the populations was 97%. Mantel test revealed that there was positive correlation between genetic distance and geographical distance（r=0.299， P<0.05） among the populations. The results are helpful to develop scienfific and valid strategies for protecting the biodiversity of H. bodinieri.

Key words： Handeliodendron bodinieri， microsatellite（SSR）， endangered plant， genetic diversity， capillary electrophoresis

掌葉木（Handeliodendron bodinieri）属于无患子科（Sapindaceae）掌叶木属（Handeliodendron）植物，是中国特有单种属中国孑遗植物（傅立国和金鉴明，1992），又称鸭脚板、平舟木、韩德木，被列为国家I级保护植物。仅分布于我国广西与贵州接壤的喀斯特地貌的石灰岩山地常绿阔叶林中，海拔高度在500～900 m之间的疏林或林缘，密集的树林中较少。广西北部的乐业、田林、东兰、环江、南丹和贵州南部的荔波、平塘、独山等地（张著林等，2000）。木材质地坚硬，是用于工程建筑及制作家具的良好材料，且种子可用于榨油，具有重要的经济开发价值（贾良志和周俊，1987；陈波涛等，2007）。掌叶木根系发达，依靠根系深入到石缝之中吸取养料来维持生存；具掌状复叶，与其它无患子科植物的羽状复叶不同。其植物分类系统位置介于无患子科与七叶树科之间，对于研究无患子科和七叶树科的系统发育具有重要的意义。

遗传多样性是指存在于不同生物个体内、单个物种内及多个物种间总的遗传变异（Hughes et al，2008）。由于单一或生物个体较稀少的物种中遗传变异是有限的，所以较难适应千变万化的环境；而在不同个体中，居群拥有丰富的遗传变异，因此能更好地去适应变化中的环境（Rao & Hodgkin，2002；Pauls et al，2013）。不同物种间多样性与不同群体遗传结构有很大的区别，所以，采取正确的策略和措施对物种进行保护，前提一定要建立在对该物种群体遗传学的研究之下（趙冰等，2015）。微卫星又称简单重复序列（SSR），是现阶段研究群体遗传多样性较好的标记（Arnold & Emms，1998） 。SSR标记在真核生物基因组中是随机分布的，由于其丰富的多态性和共显性遗传等特征，被广泛应用于种间和种内遗传多样性的分析。国内有开展过掌叶木的有性繁殖、芽苗移栽、迁地保护、居群生态、种子生态以及生物学特性等研究（周洪英和张著林，2000；韦小丽等，2006；黄仕训等，2002；张著林和林昌虎，2006；常进雄等，2002；熊志斌等，2003； 曹丽敏等，2006）。但是，在群体遗传多样性方面的研究相对滞后，仅见Wang et al（2008）、贺瑞坤等（2011）进行了掌叶木微卫星分子标记的相关开发及He et al （2012）对掌叶木的遗传多样性和居群遗传结构的研究报道， 但研究中取的居群数仅为茂兰自然保护区一个，结果尚需进一步验证。

本研究通过前人已开发的SSR引物，对掌叶木自然分布区采集8个居群进行实验，试图进一步确认掌叶木的居群遗传多样性和遗传结构，为掌叶木生物多样性保护和利用提供更充分的科学依据。

1材料与方法

1.1 材料

在掌叶木植物分布范围内进行居群广泛调查与采样，从广西西北部的东兰（DL）、南丹（ND）、环江（HJ）、乐业（LY）、田林（TL）到贵州南部的独山（DS）、荔波（LB）、平塘（PT）8个居群（表1），分别采集24个个体（个体之间的距离在30 m 以上，以免克隆株）的新鲜叶片，个体数量相等才能更科学的衡量遗传多样性水平。硅胶干燥保存，带回实验室放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与检测采用博迈德快速提取试剂盒（购自北京博迈德生化科技有限公司）对掌叶木叶片进行总DNA提取。采用紫外可见分光光度计对DNA的含量及纯度进行测定，所提取的DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 PCR扩增与毛细管电泳通过隔号选取96个双数掌叶木个体DNA进行实验。用9对SSR引物对96份掌叶木材料进行PCR扩增，9对引物分别从前人已开发（Wang et al， 2008； 贺瑞坤等， 2011）并通过筛选进行实验（表2），在正向引物5′端以磷荧光染料标记。

PCR总反应体系在10 μL的体积中进行，包括模板DNA 0.5 μL，正反引物各0.6 μmol·L1，2×PCR Master Mix 5 μL，加ddH2O补至10 μL。反应程序如下：先95 ℃条件下预变性5 min，而后95 ℃变性30 s，52～56 ℃（视引物Tm值而定）退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后在72 ℃条件下在延伸4 min，4 ℃保存。

利用毛细管电泳法（CE）将PCR的产物在ABI3730 XL基因分析仪上进行检测结果。每个CE样品中含有0.3 μL PCR产物、0.5 μL Genescan500分子量内标和9.5 μL去离子甲酰胺。混合加入96孔板，95 ℃变性5 min，4 ℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测，PCR产物和Genescan500分子量标准品的荧光信号均可在毛细管电泳的过程中由基因分析仪自动保存（图1，图2）。

1.2.3 数据分析使用GeneMarkerV2.2.0软件对ABI3730XL基因分析仪收集到的数据进行分析，统计得出不同的SSR引物对掌叶木扩增得到的SSR标记片段，将SSR标记片段与Genescan500分子量内标比较，得到不同片段长度大小序列，利用Genepop软件和GenAlEx 6.5软件进行数据分析，计算掌叶木各居群的多态位点百分率、Neis基因多样性（Nei）、Shannons遗传多样性信息指数、遗传分化系数（Fst）、基因流（Nm）、居群间遗传距离与遗传一致度，及AMOVA分析和Mantel相关分析性检验等，并利用MEGA5.0软件来构建NJ遗传关系树。

2结果与分析

2.1 居群遗传多样性参数

通过隔号选取96 份掌叶木个体，筛选出9 对SSR 分子标记，进行遗传多态性分析，结果见表3。由表3可知，单个居群的多态性位点百分率（PPB）变化范围在89%～100%之间，平均为97%，观测等位基因数（Na）变化范围在2.889～4.444之间，平均为3.903，有效等位基因数（Ne）变化范围在2.283～2.791之间，平均为2.545，期望杂合度（He）变化范围在0.442～0.568之间，平均为0.521，Shannons多态性信息指数（I）变化范围在0.818～1.061之间，平均为0.962。8个居群按各多样性指标排序，结果表明，东兰（DL）居群的遗传多样性最高（PPB=100%， He=0.564， I=1.061），PIC值为0.511，环江（HJ）居群的信息指数最低（PPB=89%， He=0.483， I=0.818），PIC值为0.421，且与其他居群的差异较为显著。通过研究结果比较，在本研究中， 掌叶木的期望杂合度（He=0.442～0.568，Mean=0.521），与He et al（2012）研究掌叶木的期望杂合度（He=0.463～0.510，Mean=0.489），数值较为相近。

2.2 居群遗传结构

为进一步研究掌叶木居群间的遗传分化程度，根据9对SSR引物扩增的结果，计算各居群间的Neis遗传距离（GD）和遗传一致度（GI），以此来判定居群间相互关系的远近，表明每8个居群之间彼此关系的密切程度。由表4 中的数据可知，掌叶木8个居群间的遗传一致度为（GI=0.849～0.970），遗传距离为（GD=0.032～0.164），即8 个居群的遗传一致度较高，遗传距离较小，彼此之间关系密切。根据遗传距离利用UPGMA法对8 个居群进行聚类分析，聚类结果见图3。从图3可以看出，掌叶木这8 个自然居群基本上符合了采集点的地理分布。

2.3 居群遗传分化

2.3.1 遗传分化系数利用GenAlEx 6.5 软件统计掌叶木9 个微卫星位点的遗传分化系数（Gst）、Nei标准遗传分化系数（G′stH）、Hericks标准遗传分化系数（G′stH）、Josts变异估计（Dest）等指数（表5）。表5结果显示，在9对SSR引物中，8 个掌叶木居群的平均Nei标准遗传分化系数（G′stN）为0.031，平均Hericks标准遗传分化系数为0.064。

根据Neis总基因多样性（Ht）及居群内基因多样性（Hs）来计算掌叶木的遗传分化水平（Gst）。由表6可知，掌叶木居群的总基因多样性平均为0.552，其中居群内基因多样性平均为0.521，Neis的基因分化系数平均为0.027，表明总变异中有2.7%的变异存在于居群间，97.3%的变异存在于居群内。各居群间的基因流（Nm）为3.368，居群内的遗传分化大于居群间的分化。

2.3.2 分子遗传变异分析（AMOVA）通过对掌叶木96个样品进行AMOVA分析，从居群遗传变异分析结果（表7）可以看出，来源于居群间的遗传变异占3%，而来源于居群内的遗传变异占97%，表明居群内的遗传变异大于居群间， 遗传分化达到了极显著水平（P<0.001）。AMOVA分析结果与基因分化系数（Gst）值所得结果一致。

2.4 Mantel相关性检验

在本研究中，利用Mantel检测遗传距离（GD）和地理距离（GGD）的相关性，结果见图4。由图4的线性关系来看，图中直线表明为正相关，且r=0.299， P=0.01， P<0.05为显著，说明掌叶木遗传距离与地理距离显著正相关。

3讨论

3.1 掌叶木的遗传多样性

SSR分子标记具有较好的稳定性、多态性高、共显性、引物特异性强等特点，是重要的DNA标记技术之一（高志红等，2002），且该技术较成熟，因此被广泛运用于遗传多样性的研究当中。采用不同分子标记进行研究的群体具有较大差别的遗传多样性（徐立安等，2001；朱其慧等，2002）。

以观测等位基因数（Na）作为衡量 SSR 位点多态性和居群变异程度高低的重要指标。在本实验中，使用的9 个SSR 位点在8 个掌叶木居群上的平均观测等位基因数为 3.903。 以Shannons 信息指数作为评价遗传多样性的重要指标；以生物多样性指数PIC值来说明不同居群间的遗传多样性。在本研究中，9 个 SSR 位点在 8 个掌叶木居群上得到其物种水平上I= 0.962，PIC平均值为0.465，表明不同居群间的遗传多样性较高。掌叶木的期望杂合度（He=0.442～0.568，Mean=0.521），与He et al（2012）研究掌叶木的期望杂合度（He=0.463～0.510，Mean=0.489），数值较为相近。而与掌叶木的一个近缘种无患子科伞花木（Eurycorymbus cavaleriei）（He=0.710～0.754）相对而言，掌叶木的遗传多样性较低。

3.2 居群遗传结构

掌叶木8个居群间的遗传一致度为（GI=0.849～0.970），遗传距离为（GD=0.032～0.164），即8 个居群的遗传一致度高，遗传距离较小，彼此之间关系密切。基于遗传距离进行聚类分析，发现掌叶木这8 个自然居群基本上符合了采集点的地理分布。

遗传分化是反映遗传结构的重要指标。本研究中8 个掌叶木居群的平均Nei标准遗传分化系数为0.031，平均Hericks标准遗传分化系数为0.064， Neis的基因分化系数平均为0.027，说明总变异中只有2.7%的变异存在于居群间，97.3%的变异存在于居群内，大部分变异来自于居群内。居群内的遗传分化大于居群间的分化。用AMOVA方法进行方差分析结果表明： 掌叶木居群间变异占3%，居群内变异占97%，居群间和居群内的变异均是极为显著（P<0.001） ，此分析结果与基因分化系数所得结论一致。

一般认为当基因流（Nm）大于1时，则它能足以抵制遗传漂变的作用，并能防止遗传漂变导致居群遗传分化的发生（Slatkin，1981）。通过本实验研究，测得的居群间基因流值为3.368，属于较高水平，这表明各居群间基因交流较为频繁。在本实验研究中，居群间存在一定的基因交流很可能是影响8 个居群遗传结构的主要因素。用于本研究中所涉及到的 8 个居群均来自喀斯特地貌，推测其原因可能为（1）因为掌叶木的花粉可以随风散播，花粉与种子可以随风四处散播（Greene，2005）；（2）河流和以掌叶木果实为生的动物是远距离的传播基因交流等。

通过计算得出的遗传距离和地理距离，利用Mantel检测进行相关性分析，得出结论：r=0.299， P=0.01， P<0.05为显著，遗传地理与地理距离显著正相关。由于掌叶木分布范围较小，生长在中国特有的喀斯特地貌，且其分类地位孤立。因此，掌叶木的遗传距离与地理距离呈正相关，和其分布的地理位置有关。

通过野外调查得知，掌叶木多以星散分布为主，密林中很少见，多生长在疏林或林缘。掌叶木的自然分布居群有相对较高的遗传多样性， 但是由于人为破坏等因素导致该群体濒危，而濒危并不是因为遗传多样性降低而造成的。本研究首次对掌叶木目前已知的所有居群进行遗传多样性分析，而同类研究掌叶木的 Wang et al （2008）、贺瑞坤等（2011）及He et al（2012）都只是選取了生长在荔波的一个居群。其中，Wang et al （2008）及贺瑞坤等（2011）开发了掌叶木的微卫星SSR引物，但未对其遗传多样性进行分析研究。因此，本研究对于分析掌叶木的遗传多样性信息更具有科学依据。从实验结果显示，掌叶木单个居群内遗传多样性较丰富，但是居群间遗传分化较小。因此，通过该实验得到的遗传信息将为濒危植物掌叶木生物多样性保护和利用提供科学的依据。在掌叶木保护措施上，应该以居群保护为重点，并且在较大程度内保护现有个体数量的完整性来维护掌叶木居群的繁衍，应加大保护防止生长在林缘的掌叶木个体因人为砍伐或其他因素破坏而造成遗传多样性损失。

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