四川稻城传统干酪中乳酸菌的分离鉴定及功能研究

刘绒梅 田圆圆 耿琦 史健阳 张越 孙群

摘 要：为获取具优良加工性能和降解胆固醇功能的乳酸菌，从四川稻城两类传统干酪（牦牛奶饼、酥油奶饼）中分离筛选得到7株乳酸菌，经16S rRNA序列鉴定有5株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。对其进行耐酸、耐胆盐、表面疏水性及自聚合能力、抑菌和降胆固醇检测，结果表明，7株菌均具一定的耐酸和耐胆盐能力，在pH 3.5和0.1%胆盐浓度条件下可生长；菌株N-4疏水性达29.57%，N-8自聚能力达66.09%；菌株N-8对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为11.17 mm和15.00 mm，抑菌能力均强于其他菌株；菌株N-1可降解培养基中的胆固醇，降解率达31.77%，有望利用其发酵生产具降胆固醇能力的新型功能性乳制品。综上，从传统干酪中分离筛选的乳酸菌具有潜在的益生功能，可应用于功能性乳制品开发。

关键词：传统干酪；乳酸菌；功能特性；胆固醇

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2017）12-0058-05

Abstract： In order to obtain lactic acid bacteria（LAB） of excellent processing properties and beneficial functions of lowering cholesterol， seven strains of lactic acid bacteria were isolated from two kinds of traditional cheese from Daocheng， Sichuan， among which five were identified as Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequence. All strains were subjected to acid and bile salt resistance， surface hydrophobicity and self-aggregation， antibacterial and cholesterol-lowering test. The results showed that all the bacterial strains had a certain degree of acid resistance and bile salt tolerance， and they could grow under the conditions of pH 3.5 and 0.1% bile salt. The hydrophobicity of N-4 was 29.57% and the self-aggregation capacity of N-8 was 66.09%； The antibacterial activity of N-8 to Escherichia coli and Staphylococcus aureus was the strongest， with the inhibition zone being 11.17 mm and 15.00 mm， respectively. The strain N-1 can degrade the cholesterol in the medium， and the degradation rate was 31.77%， and it is expected to be applied on the development of new functional dairy products with the ability of lowering cholesterol. In conclusion， LAB strains isolated from traditional cheese has a potential probiotic function.

Keywords： traditional cheese； lactic acid bacteria； function properties； cholesterol

0 引 言

传统发酵乳制品具有悠久的历史，其蕴含着丰富的微生物资源，成为近年来研究的热点。稻城县地处中国四川省西南边缘，属于青藏高原东南部属康巴藏区的甘孜藏族自治州，传统发酵而成的奶制品是当地的重要食品。这些传统奶制品是通过本土菌株发酵而成，经过长期驯化，具有优良性状的菌株得以保留。大量研究表明，传统乳制品中的优势菌株为乳酸菌[1-2]。从传统乳制品中分离筛选得到的乳酸菌具有多种益生功能，并对人体有多种功效，得到了广泛的应用[3]。目前研究最多的是新疆、内蒙古一带的传统发酵乳，内蒙古农业大学经过10年的研究，在2007年建立起了中国第一个具有自主知识产权的乳酸菌菌种资源库[4]，而西南地区传统发酵乳中乳酸菌的相关研究相对较少。此外，乳制品中乳酸菌生物多样性随不同地区和制作方式而不同。因此，从不同地区不同种类的传统发酵乳制品中分离、筛选具优良性能和功能的乳酸菌菌种，对新型和功能性乳品及其他发酵行业的发展具有重要意义。

本研究从四川稻城地區2类常见的传统乳制品（奶饼、酥油奶饼）中分离筛选到15株乳酸菌，对初筛后的7株乳酸菌进行耐酸、耐胆盐、表面疏水性及自聚合能力、抑菌和降胆固醇试验的研究，最终得到1株可在体外将胆固醇降解31.77%的植物乳杆菌N-1，其余菌株也表现出一定的优势特点，丰富了西南地区功能乳酸菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样 品

两份干酪样品（奶饼、酥油奶饼）采自四川省稻城县木拉乡卡龙村，是当地牧民发酵的牦牛乳制品。

1.1.2 菌 种

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），系本实验室保藏菌种。

1.1.3 试 剂

邻苯二甲醛（98%），牛胆盐（上海源叶生物科技公司）；胆固醇（上海惠世生化试剂有限公司）。

MRS液体培养基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉6.0 g，吐温80 1.0 mL，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，纯水1 L，pH自然（加1.5%～2.0%琼脂为固体培养基）。

MRS-胆固醇培养基：MRS液体培养基中添加不同浓度的牛胆盐，并加入胆固醇使培养基中胆固醇终浓度为100 μg/mL。

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出物5.0 g，氯化钠10.0 g，纯水1 L，pH自然（加1.5%～2.0%琼脂为固体培养基）。

PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.2 g， 磷酸氢二钠1.15 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，加入800 mL 纯水搅拌溶解，浓盐酸调至相应pH值，定容至1 L。

1.2 仪器与设备

AFZ-100Z-U 超纯水仪（美国艾科浦公司）；PS-25精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；BX53F光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；UV-2600紫外分光光度计（日本SHIMADZU公司）；TGL-16G台式冷冻高速离心机（上海医用分析仪器厂）；TS-1小型摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的分离、纯化及初筛

两份样品各称取10 g，于装有90 mL无菌水的锥形瓶中充分搅拌，置于摇床振荡60 min，使样品完全分散。吸取悬液，10倍梯度稀释分别涂布于MRS固体培养基上，37 ℃培养48 h，肉眼观察挑取不同形态和大小的单菌落，平板划线纯化3次。革兰氏染色，触媒试验初步确定为疑似乳酸菌，将纯化好的菌株保存于50%甘油中，-40 ℃冷冻保存备用。

将分离纯化得到的菌株以10%的接种量分别在pH 3.5和含0.1%牛胆盐的MRS液体培养基中培养20 h，分别测定0 h和20 h的OD600。对在这两个条件下均可生长的菌株进一步研究。

1.3.2 菌株鉴定

采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，细菌通用引物27F/1492R扩增16S rRNA，将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对。

1.3.3 菌株耐酸和耐胆盐试验

耐酸试验：将活化三代的乳酸菌以1%的接种量分别接种至pH为3.5、2.5、2.0的PBS缓冲液中，37 ℃静置培养3 h，梯度稀释平板法测定乳酸菌活菌数。

耐胆盐试验：将活化三代的乳酸菌以1%的接种量分别接种至含0.1%、0.2%、0.3%的牛胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养5 h，梯度稀释平板法测定乳酸菌活菌数。

1.3.4 疏水性和自聚力试验

疏水性试验参考Sadishkumar[5]的方法稍加修改。乳酸菌于37 ℃，120 r/min摇床培养24 h， 4 ℃，5 000 g离心5 min，弃上清，收集菌体沉淀。pH值为7.4的无菌PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次，重悬于无菌的PBS缓冲液中，调整菌悬液的吸光值（OD600 nm）为0.8±0.05（A0）。取2 mL菌悬液与2 mL二甲苯充分振荡混匀，室温静置30 min。小心吸取水相，于600 nm下测定吸光值（A1）。

表面疏水性=（1-A1/A0）×100%

自聚力试验参考Todorov等[6]的方法稍加修改。菌悬液制备同疏水性试验，取4 mL菌悬液，室温静置24 h。小心吸取上层1 mL，于600 nm下测定吸光值（A24）。

自聚力=（1-A24/A0）×100%

1.3.5 抑菌试验

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，乳酸菌发酵液4 ℃，10 000 g离心 10 min，其上清液经0.22 μm滤膜过滤除菌进行抑菌试验。将浓度为105 CFU/mL的指示菌培养液100 μL分別涂布于LB固体平板上，用镊子夹取已灭菌的牛津杯放到 LB 固体培养基上，牛津杯中滴加200 μL除菌的乳酸菌上清液。37 ℃培养 16 h后，测量抑菌圈的直径。

1.3.6 体外降胆固醇能力

体外降解胆固醇试验参照Shehata等[7]的方法并加以修改。将活化三代的乳酸菌按1%的接种量接种至MRS-胆固醇培养基，37 ℃ 120 r/min摇床培养24 h。4 ℃下10 000 g离心 10 min，取1 mL上清液于具塞比色管，加入1 mL 33%的KOH和2 mL无水乙醇，涡旋振荡90 s，37 ℃水浴15 min，冷却至室温，加入2 mL无菌水和3 mL正己烷，涡旋振荡60 s，静置10 min，取上层液体1 mL于新的试管65 ℃水浴蒸干，加入2 mL邻苯二甲醛-冰乙酸溶液（0.5 mg/mL），混匀，室温避光反应 10 min，加入1 mL 浓硫酸终止反应，静置 10 min，测其在 550 nm处吸光值。

降解率=（1-A1/A0）×100%

式中：A1——接种乳酸菌的培养液经上述处理后的OD值；

A0——未接种乳酸菌的培养液经上述处理后的OD值。

所有试验均重复3次，每次设3个平行，取平均值。

2 结果与分析

2.1 分离初筛的乳酸菌及鉴定

初步分离到20株疑似乳酸菌的菌落，革兰氏染色、触媒试验确定5株非乳酸菌。对其余15株进行耐酸及耐胆盐初筛，只有7株能在pH 3.5和0.1%胆盐浓度条件下生长，对其进行16S rRNA鉴定，结果如表1所示。7株菌中有5株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），分别是N-1，N-4，N-5， N-8，S-3，而N-2和S-7被鉴定为Lactobacillus sp.。

2.2 耐酸和耐胆盐能力

乳酸菌耐酸试验结果如表2所示。随着pH值的下降，7株乳酸菌的活菌数明显减少。当pH值为2.5时，活菌数下降3～4个数量级，当pH值为3.5时，除S-3和S-7外，其余5株菌的存活率达95%以上，表明筛选到的乳酸菌对酸有一定的耐受性。

乳酸菌耐胆盐试验结果如表3所示。随胆盐浓度升高，7株乳酸菌的活菌数呈递减趋势。当胆盐浓度为0.1%时，存活率均在95%以上，当胆盐浓度为0.2%时，乳酸菌的活菌数还能保持在106 CFU/mL。表明筛选到的乳酸菌对胆盐有一定的耐受性。

2.3 疏水性和自聚合能力

细菌表面疏水性和自聚合能力常作为益生菌对肠道黏附特性的初筛指标[8]。乳酸菌疏水性和自聚力试验结果如表4所示。7株乳酸菌的疏水性和自聚力相差不大，其中菌株N-4的疏水性较高，达29.57%，而菌株N-8的自聚能力最强，达66.09%。

2.4 抑菌试验

乳酸菌发酵上清液对常见致病菌和条件致病菌的抑菌效果如表5所示。7株乳酸菌发酵上清液抑制金黄色葡萄球菌的能力强于大肠杆菌，其中菌株N-8对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强，抑菌圈直径分别为11.17 mm和15.00 mm。

2.5 乳酸菌体外降胆固醇能力

7株乳酸菌体外降解胆固醇试验结果如图1所示。菌株N-1降解胆固醇的能力最强，达31.77%，S-7次之，为27.64%。

3 讨 论

本研究从两类干酪样品中分离初筛选到7株乳酸菌，通过16S rRNA基因序列分析，其中有5株为植物乳杆菌（L. plantarum），占分离菌株的绝大部分。这与Sun等[9]从青海海南州、海西州和海北州等地区采集的自然发酵牦牛乳中植物乳杆菌（L. plantarum） 和乳酸乳球菌乳酸亚种（Lc. lactis subsp.lactis）为优势菌群的研究相符；与之不同的是，张和平[10]研究表明四川地区自然发酵乳优势菌为嗜热链球菌（S. thermophilus）和瑞士乳杆菌（L. helveticus），而Bao等[11]研究表明四川紅原草原20份酸牦牛乳中嗜热链球菌（S. thermophilus）是优势菌群。这表明不同地区和不同制作方式的传统发酵乳中乳酸菌生物多样性不同，优势菌群也不同。赵建[12]的研究表明植物乳杆菌SP-3不仅能够加快干酪体系中蛋白质的水解进程，促进干酪成熟，还能提高产品的风味强度和风味接受度。

乳酸菌作为一种益生菌，只有具有良好的耐酸和耐胆盐能力才能发挥益生作用。非空腹状态下人体胃液的pH值在2.5～3.5的范围内波动，小肠中胆盐的质量浓度在0.03%～0.3%范围内波动[13]。7株乳酸菌在pH 3.5和0.1%胆盐浓度的条件下存活率达90%以上，可在胃肠道存活，具有一定的益生潜力。菌株N-4的疏水性最高，而菌株N-8的自聚力最高，均高于Das等[14]文献所报道，表明这两株菌对肠道的黏附性可能较强。

研究表明，乳酸菌对致病菌有一定抑制作用，其代谢物得到广泛应用[15-16]。菌株N-8发酵上清液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较强的抑菌能力，具有潜在的应用价值。

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，过多胆固醇的摄入会导致高血脂症，进而会引发冠心病等心脑血管疾病，严重威胁人类健康[17]。已有研究表明乳酸菌对胆固醇的降低有积极作用[18]。而筛选得到的菌株N-1可在体外将胆固醇降解31.77%，与之相似的是刘晓强[19]从传统酸肉中筛选得到一株高效降胆固醇的消化乳杆菌CT24，其降低率达31.23%。因此，该菌株有望添加到功能性食品中进一步研究、开发和应用。

4 结束语

本研究筛选得到的7株乳酸菌来自四川稻城传统乳制品，有利于西南地区乳酸菌资源的收集。通过功能筛选，获得了2株具有潜在价值的乳酸菌，即一株有较强抑菌能力，另一种有较强降胆固醇能力，可为乳酸菌在功能性食品中的应用提供参考。

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（编辑：莫婕）