HPLC法测定生脉注射液中特征成分莽草酸

吴建国 董礼 陈虹静 徐小平

摘 要：采用液质联用法对生脉注射液中莽草酸成分进行确认，建立高效液相色谱法测定生脉注射液中莽草酸含量。采用液质联用法测定目标峰的分子离子峰m/z：173.08[M-H]-，与莽草酸对照品对比确认目标峰为莽草酸成分；色谱柱采用Synergi Hydro-RP 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm），以20 mmol/L的KH2PO4（H3PO4调pH至2.5）溶液为流动相，流量为0.6 mL/min，检测波长214 nm；莽草酸在0.02～0.64 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.999 8，精密度、重复性试验RSD分别为0.15%和1.49%，平均加样回收率为99.2%，RSD=1.56%。该研究首次确认生脉注射液中含有莽草酸成分，且该成分来源于五味子；含量测定方法准确、可靠，可作为生脉注射液中五味子成分质量控制检测方法。

关键词：生脉注射液；质量控制；有机酸；高效液相色谱

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2017）12-0041-04

Abstract： Identification of shikimic acid in Shengmai injection was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry，To establish an HPLC method for determining Shikimic acid in Shengmai injection. The liquid chromatography-mass spectrometry determination confirmed that the target peak was Shikimic acid by comparing the molecular ion peak weight（m/z：173.08[M-H]-） with Shikimic acid standard substance.The analysis was performed on a Synergi Hydro-RP 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm）， mobile phase was 20 mmol/L KH2PO4 （tune pH to 2.5 with H3PO4）， flow rate was 0.6 mL/min， detection wavelength at 214 nm. It was a good linear relationship of Shikimic acid content among 0.02 to 0.64 μg， r=0.999 8. The RSD of precision and repeatability were 0.15% and 1.49% respectly. The average recovery was 99.2%， RSD=1.56%. The study identified the existence of Shikimic acid in Shengmai injection for the first time. And the component derived from Schisandra chinensis. The content determination method was accurate and reliable. It could be used for the quality control of Schisandra chinensis in Shengmai injection.

Keywords： Shengmai injection； quality control； organic acid； HPLC

0 引 言

生脉注射液为华西医科大学药学院根据我国古验方“生脉散”研制而成的中药注射剂，由红参、麦冬、五味子3味药组成[1]。五味子性温，味酸、甘，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，主要用于久嗽虚喘、滑精尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、心悸失眠等症[2]。五味子中化学成分为挥发性成分、木脂素类、有机酸类、多糖类及其他成分[3]。2011年10月25日，由国家药典委员会审定，国家食品药品监督管理局颁布正式执行生脉注射液新质量标准[4]。該标准对五味子中特征成分，五味子醇甲进行了定量控制，但对有机酸成分未进行控制。莽草酸，广泛存在于八角茴香[5]、五味子[6]、松柏[7-8]、银杏[9]等植物中；是抗击禽流感最有效药物“达菲”的主要合成原料[10]，文献报道，莽草酸具有抗动脉粥样硬化作用，可改善AS大鼠炎症状态，能够抑制sPLA2-IIA mRNA[11]，对小鼠具有明显的镇痛作用[12]；提示莽草酸为生脉注射液中有效成分之一。目前，关于五味子莽草酸含量测定研究未见报道，红参、麦冬药材中也未发现莽草酸成分。因此，为加强生脉注射液五味子成分的质量控制，本文将采用液质联用法对生脉注射液中莽草酸成分进行确认，并用高效液相色谱法测定本品中莽草酸的含量，为生脉注射液的质量研究提供依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪 器

Agilent 1100高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；LCQ-FLEET液质联用仪（赛默飞世尔科技有限公司）；METTLER TOLEDO XA205DU型电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）。

1.1.2 试 剂

磷酸二氢钾（分析纯，天津市博迪化工有限公司）；乙腈（色谱纯，Merk）；莽草酸对照品（MUST-11061702，成都曼斯特标准品有限公司）；生脉注射液由雅安三九药业有限公司生产；实验所有用水均为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 检测条件

高效液相色谱条件：色谱柱采用Synergi 4 μm Hydro-RP 80 A（250 mm×4.6 mm，4 μm）；检测波长：214 nm；柱温：25 ℃；流动相为20 mmol/L的KH2PO4（H3PO4调pH到2.5）；流量：0.6 mL/min；进样量：5 μL。

液质联用色谱条件：色谱柱采用Synergi 4 μm Hydro-RP 80 A（250 mm×4.6 mm，4 μm）；柱温：25 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液；流量：0.6 mL/min；进样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），负离子检测方式，扫描范围50～500 m/z。鞘气压力：40 psi（1 psi=6.895 kPa），辅气压力：10 psi，毛细管温度320 ℃。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取莽草酸对照品适量，用2 mmol/L的KH2PO4溶液（H3PO4调pH至2.5）稀释至128 μg/mL，得对照品储备液；精密吸取对照品储备液适量，稀释至25.6 μg/mL，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备

取生脉注射液适量，用纯化水稀释50倍，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得阳性供试品；取红参、麦冬原料，照生脉注射液制法[4]，制得缺五味子阴性样品，再用纯化水稀释50倍，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得阴性供试品。

2 结果与讨论

2.1 色谱峰的确认

2.1.1 色谱柱的选择

采用反相高效液相色谱分离有机酸，色谱柱须耐受高比例水相。本研究采用Synergi 4 μm Hydro-RP 80 A色谱柱，该色谱柱能够耐受100%水相流动性。同时该色谱柱填料粒径为4 μm，色谱柱粒径越小，塔板高度越低，柱效越高[13]，能够提供更好的色谱分离能力。

2.1.2 专属性确认

取莽草酸对照品、供试品（生脉注射液）、缺五味子阴性供试品，分别进样，记录色谱图，见图1，从图中可以看出，莽草酸色谱峰无干扰，说明莽草酸检测专属性良好。

2.1.3 质谱确认

取莽草酸对照品、供试品（生脉注射液），按质谱色谱条件进行检测，结果见图2，从图中可以看出，生脉注射液中，与莽草酸对照品保留时间相同的位置出现分子离子峰相同的色谱峰[M-H]-173.08，说明生脉注射液中确实存在莽草酸。

2.2 检测波长的选择

文献报道莽草酸色谱检测波长有203[14]，213[7]，214[15]，217[8]，220 nm[16]。为确定莽草酸的最佳检测波长，本研究采用DAD检测器检测莽草酸色谱峰光谱图，见图3，从图中可知莽草酸在该流动相下最大吸收波长为214 nm。因此，选择214 nm波长为莽草酸含量测定的最佳检测波长。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

精密吸取莽草酸对照品储备液适量，用2 mmol/L的KH2PO4（H3PO4调pH至2.5）溶液稀释为4，8，16，

32，64，128 μg/mL的溶液。精密吸取5 μL，注入高效液相色譜仪进行分析。以莽草酸峰面积（y）对进样量（x），进行线性回归，得回归方程为y=4.97×103x+43.4，r=0.999 8，结果表明莽草酸进样量在0.02～0.64 μg范围内，峰面积与进样量之间呈良好的线性关系。

2.3.2 进样精密度

取对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，以莽草酸峰面积计算RSD=0.15%，结果表明进样精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批号生脉注射液（批号：130507）6份，照1.2.3项制得阳性供试品6份，分别进样，进样量5 μL，以莽草酸峰面积计算RSD=1.49%，结果表明方法重现性良好。

2.3.4 中间精密度

取同一批号生脉注射液（批号：130507），分别在不同时间（7 d），随机3人，照1.2.3项制得阳性供试品，检测莽草酸含量。以莽草酸含量计算RSD=2.25%，结果表明方法中间精密度良好。

2.3.5 稳定性试验

取2.3.4项下一阳性供试品，在0，2，4，8，12，24 h进样，进样量10 μL，以莽草酸峰面积计算RSD=0.85%，结果表明莽草酸在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验

精密吸取生脉注射液（批号：130507，照1.2.1色谱条件测得莽草酸含量为1.31 mg/mL）9份，每份0.1 mL，置于5 mL容量瓶中；精密吸取对照品储备液1.5，

1.0，0.5 mL各3份，分别加入容量瓶中；用纯化水稀释至刻度，经0.45 μm微孔滤膜过滤，制得供试品溶液。照2.1色谱方法进行检测，计算回收率，得平均回收率为99.2%，RSD=1.56%，见表1。

3 结束语

本文建立了生脉注射液中五味子特征成分莽草酸的高效液相测定方法；通过液质联用技术，结合莽草酸对照品，确认了生脉注射液中含有莽草酸；通过方法学考察，表明生脉注射液中莽草酸含量测定方法准确可靠。莽草酸作为生脉注射液中五味子成分的特征成分，具有很好的药理活性，且含量较高，因此，莽草酸含量测定可以作为生脉注射液质量控制的新指标；为本品在五味子成分方面的质量控制进一步提升提供依据。

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（编辑：莫婕）