谷氨酰胺转氨酶发酵工艺优化及其酶学性质

王兴吉 刘文龙 郭庆亮 张杰

摘要[目的]研究茂源链霉菌LD195产TGase的最佳发酵工艺条件，并探讨TGase的酶学特性。[方法]采用L9（34）正交试验对产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株培养基和培养条件进行优化。[结果]最佳无机盐配方为Na2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 3.0 g/L，最佳培养条件为培养温度30 ℃，装液量25 mL，摇床转速200 r/min，接种量10%。该谷氨酰胺转氨酶的最适反应温度为50 ℃，在40～60 ℃条件下保温30 min酶活基本没有损失；最适反应pH为6.0，在pH为5.0～7.0条件下保存30 min仍具有85%以上酶活；同时Fe3+、Cu2+ 、Zn2+会强烈抑制酶的活性。[结论]茂源链霉菌LD195产TGase具有良好的耐酸性和耐热性，在商业化生产中具有广阔前景。

关键词培养基；茂源链霉菌；谷氨酰胺转氨酶；酶学性质

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）32-0161-04

Fermentation Process Optimization of Transglutaminase and Its Enzymatic Properties

WANG Xingji，LIU Wenlong*，GUO Qingliang et al（Shandong Long Kete Enzyme Co.，Ltd.，Shandong Province Key Laboratory of Enzyme Preparation Fermentation Technology ，Linyi，Shandong 276400）

Abstract[Objective]To investigate the optimum fermentation conditions of TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 and explore the enzymatic properties of TGase.[Method] L9（34） orthogonal design on media and culture conditions of Streptomyces lanceolata were optimized.[Result]The best medium： Na2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 3.0 g/L.The optimal culture conditions： culture temperature 30 ℃，bottling capacity 25 mL，agitation rate 200 r/min，inoculums size 10%.The produced TGase exhibited optimum activity at 50 ℃ and pH 6.0.It was stably incubated in 40～60 ℃ for 30 min and the remained enzyme activity was above 85% dealed with pH 5.0～7.0 for 30 min.The enzyme was strongly inactivated by Fe3+，Cu2+，Zn2+.[Conclusion]TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 has good acid resistance and heat resistance，and which has broad prospects in commercial production.

Key wordsMedium； Streptomyces lanceolata；Transglutaminase；Enzymatic properties

谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase.EC2.3.2.13，TGase），又稱转谷氨酰胺酶（TGase），是一种催化酰基转移反应的转移酶，是由331个氨基组成的分子量约38 000的具有活性中心的单体蛋白质，可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间共价交联[1-2]，从而改善蛋白质的结构和功能，影响蛋白质的性质，如发泡性、乳化性、乳化稳定性、热稳定性、保水性和凝胶能力等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等，目前已经被广泛应用于食品工业。但由于其生产成本过高，严重限制了该酶的推广及使用[3]。

微生物来源的TGase（Microbial transglutaminase，MTG）主要来自于芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和链霉菌属（Streptomyces spp.）。从茂源链轮丝菌（Streptomyces mobaraensis）中分离得到的TGase，酶分子量为37.9 kD，由331个氨基酸组成，活性中心含有1个半胱氨酸残基，活性不依赖钙离子[4]。此外，研究者在Streptomyces hygroscopic[5]、Streptomyces griseoverticillatumt[6]、Bacillus circulans[7]、Streptomyces libani[8]及Bacillus subtilis[9]等微生物中也发现了TGase的存在，并且进行了酶纯化、发酵工艺优化、基因工程表达等相关研究， 取得了一定成果。目前仅S.mobaraensis来源的TGase实现了商业化生产，其他微生物仍处于研究阶段。该研究探讨了茂源链霉菌产TGase的最佳发酵工艺条件，分析了TGase的酶学特性，以期为TGase的商业化生产提供依据。

1材料与方法

1.1菌株

茂源链霉菌为山东隆科特酶制剂有限公司山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室筛选保藏菌种（Streptomyces lanceolata），命名为LD195。

1.2培养基及其优化

1.2.1基础培养基。

1.2.1.1斜面培养基。麦芽粉3 g/L，酵母膏4 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂粉15 g/L，pH 7.0。

1.2.1.2种子培养基。葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨20 g/L，大豆粉15 g/L，磷酸氢二钠2.0 g/L，磷酸二氢钾2.5 g/L，硫酸镁1.0 g/L，氯化钙5.0 g/L，pH 7.0。

1.2.1.3发酵培养基。葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨20 g/L，大豆粉15 g/L，磷酸氢二钠2.0 g/L，磷酸二氢钾2.5 g/L，硫酸镁1.5 g/L，氯化钙3.0 g/L，pH 7.0。

1.2.1.4孢子萌发培养基。2×YT培養基。

1.2.2无机盐优化的正交设计试验。选用L9（34）正交表，对“1.2.1”基础培养基的无机盐进行正交设计试验，以找出菌体发酵最好的优化培养基，试验因素及水平见表1。

1.3培养方法及培养条件的优化

1.3.1培养方法。

1.3.1.1斜面种子培养。试管种子32 ℃恒温培养7 d。

1.3.1.2摇瓶种子培养。取1环生长好的斜面培养物，接种至装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培养24 h。

1.3.1.3摇瓶发酵培养。按接种量10%将种子液接种于装有25 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培养45 h。

1.3.2培养条件优化的正交设计试验。

选用L9（34）正交表，对“1.3.1”中培养条件进行一次正交设计试验，以找出菌体发酵最好的培养条件，试验因素及水平见表2。

1.4酶活测定方法

比色法测定酶活[10-11]：以α-NA-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟胺酸（L-glutamic acid γ-monohydroxamate）做标准曲线。1个单位 TGase的酶活为1 min催化生成1 μmol L-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量（U/mL）。

酶活测定条件：37 ℃条件下反应10 min。试剂A：将100 mg底物α-NA-CBZ-GLN-GLY完全溶解于2 mL 0.2 mol/L NaOH中，依次加入4 mL 0.2 mol/L pH6.0的Tris（三羟甲基氨基甲烷）-HCl缓冲液、2 mL 0.1 mol/L盐酸羟胺、2 mL 0.01 mol/L还原型谷胱甘肽，用NaOH固体调pH至6.0。

试剂B：3 mol/L HCl、12% TCA、5% FeCl3·6H2O这3种试剂以1∶1∶1混合配制。

准备0～12 μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单羟胺酸标准溶液，取40 μL标准溶液于1.5 mL EP管中，加100 μL试剂A，7 ℃保温10 min，加入40 μL试剂B终止反应。在吸光度525 nm下进行比色，绘制出标准曲线。以100 ℃加热10 min后离心的上清液作为空白。

1.5TGase的酶学性质测定

1.5.1TGase反应的最适温度。通过离子交换层析、凝胶过滤等方法，纯化谷氨酰胺转氨酶，对其酶学性质进行测定。

将纯化后的酶液在pH5.0条件下，分别放置于20、30、40、50、60、70 ℃保温30 min测定酶活，以处理前酶液的酶活为100%，得到相对酶活，从而确定最适反应温度。

1.5.2TGase反应的最适pH。将酶反应底物分别溶于pH为3.0～5.0的50 mmol/L的醋酸缓冲液，pH为6.0～9.0的50 mmol/L Tris-盐酸缓冲液中，设置pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共7个梯度；将纯化后的酶液经pH为3.0～5.0的50 mmol/L的醋酸缓冲液，pH为6.0～9.0的50 mmol/L Tris-盐酸缓冲液处理，分别在50 ℃下放置30 min，与相应的pH底物混合后测定酶活，以处理前酶液的酶活为100%，得到相对酶活。

1.5.3金属离子对TGase酶活的影响。

将纯化后的酶液分别加入一定浓度（5 mmol/L）的各种金属离子，在37 ℃下保温30 min，测定添加不同金属离子后的残余酶活，以不经处理的酶液的酶活为100%，得到相对酶活。

2结果与分析

2.1优化培养基正交试验结果分析

从表3可以看出，正交设计试验中4因素对菌体发酵无特别明显影响，由极差分析比较结果可知，该试验中4因素的相对影响顺序由大到小为Na2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2，即菌体发酵产酶的最高组合为A2B2C3D2，即菌体发酵产酶最高的无机盐组合为Na2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、CaCl2 3.0 g/L。

同時，通过正交试验可以看出菌体对钙离子的依赖性不强，微生物来源的TGase（MTG）不依赖于钙离子的存在，与动植物来源的TGase完全不同[12]。动物来源的TGase分子量不等，需要钙离子激活，酶活性中心为半胱氨酸残基位点。动物来源的TGase以豚鼠肝脏的TGase（GTG）研究最为深入，该酶的分子量为90 kD，其酶促反应需要钙离子激活，对底物特异性强[13]。MTG对钙离子的依赖性和底物特异性都低，因此对钙离子的需求较少，正交试验中钙离子的影响较小也验证了这一点。

2.2培養条件优化试验结果分析

从表4可以看出，A2B2C3D1为最优组合，即培养温度30 ℃，装液量为25 mL，摇床转速为200 r/min，接种量为10%时，菌体发酵产酶最好。同时，由极差分析比较可以看出培养条件对菌体产酶影响的主次顺序为培养温度、接种量、装液量、摇床转速。培养温度对菌体生长影响最大，由于选择摇床转速幅度较小，其对菌体生长影响较小。

2.3酶学性质

2.3.1TGase反应的最适温度及热稳定性。将纯化后的酶液分别放置在20、30、40、50、60、70 ℃进行酶活测定。由图2可知，50 ℃时，TGase相对酶活最高，接近100%，该酶的最适反应温度为50 ℃左右。在40～60 ℃时，相对酶活为75%以上，说明在此温度范围内，该酶比较稳定。

45卷32期王兴吉等谷氨酰胺转氨酶发酵工艺优化及其酶学性质

2.3.2TGase反应的最适pH及稳定性。

将酶反应底物分别溶于pH为3.0～5.0的50 mmol/L的醋酸缓冲液，pH為6.0～9.0的50 mmol/L Tris-盐酸缓冲液中，测定酶在不同pH下的酶活。由图3可知，TGase的最适反应pH为6.0左右。TGase在不同pH下50 ℃放置30 min后，酶在pH为5.0～7.0时较稳定，相对酶活为85%以上，说明该酶在pH为5.0～7.0时酶活相对稳定。

2.3.3金属离子对TGase酶活的影响。

金属离子对酶活的影响主要分为激活作用及抑制作用[14-15]。由表5可知，Na+、Mg2+、K+、Ca2+对该酶活性没有明显的抑制作用，而Fe3+、Cu2+、Zn2+会强烈抑制酶的活性，由于所选用金属离子浓度较高，金属离子没有表现出激活作用，对于低浓度下金属离子对酶的激活作用尚未验证[16]。

3结论

通过正交设计试验确定茂源链霉菌培养基中无机盐的最优组合为Na2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、CaCl2 3.0 g/L。通过试验确定最佳发酵条件为培养温度30 ℃、装液量25 mL、摇床转速200 r/min、接种量10%。

该谷氨酰胺转氨酶的最适反应温度为50 ℃，在40～60 ℃条件下保温30 min酶活维持在75%以上；最适反应pH为6.0，在pH为5.0～7.0条件下保存30 min仍具有85%以上酶活； Fe3+、Cu2+、Zn2+会强烈抑制酶的活性。

参考文献

[1]

DUBE M，SCHFER C，NEIDART S，et al.Texturisation and modification of vegetable proteins for food applications using microbial transglutaminase[J].Eur Food Res Technol，2007，225： 287-299.

[2] NONAKAM M，SAWA A，MATSUURA Y，et al.Deamidation of several food proteins using free and immobilized Ca2+：Independent microbial transglututaminase[J].Biosci Biotech Biochem，1996，60（3）： 532-533.

[3] MOTOKI M，KUMAZAWA Y.Recent research trends in transglutaminase technology for food processing[J].Food Sci Technol Res，2000，6（3）： 151-160.

[4] ANDO H，ADACHI M，UMEDA K，et al. Purificationand characteristics of a novel transglutaminase derived from microorganisms[J].Agricultural& biological chemistry，1989，53（10）：2613-2617.

[5] CUI L，ZHANG D X，DU G C，et al.Purification and characterization of transglutaminase from a newly isolated Streptomyces hygroscopic[J].Food chemistry，2007，105（2）：612-618.

[6] MOTOKI M，SEGURO K.Transglutaminase and its use for food processing [J].Trends Food Sci Tech，1998，9（5）：204-210.

[7] DE BARROS SOARES L H，ASSMANN F，AYUB MAZ.Purification and properties of a transglutaminase produced by a Bacillus circulans strain isolated from the Amazon environment[J].Biotechnol Appl Biochem，2003，37（3）： 295-299.

[8] UMEZAWA Y，OHTSUKA T，YOKOYAMA K，et al.Comparison of enzymatic properties of microbial transglutaminase from Streptomyces sp[J].Food Sci Technol Res，2002，8：113-118.

[9] SUZUKI S，LZAWA Y，KOBAYASHI K，et al.Purification and characterization of novel transglutaminase from Bacillus subtilis spores[J].Biosci Biotechnol Biochem，2000，64（11）： 2344-2351.

[10] 許建軍，江波，许时婴.比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用[J].微生物学通报，2004，31（2）：66-71.

[11] 杨帆，李江华，徐岩，等.谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化[J].食品与生物技术学报，2008，27（4）： 107-111.

[12] 崔艳华，张兰威.谷氨酰胺转氨酶研究进展[J].生物技术通报，2009（1）： 31-36.

[13] URABE H，AOYAGI N，OGAWARA H et al.Expression and characterization of the Streptomyces coelicolor serine/threonine protein kinase PkaD[J].Biosci Biotechnol Biochem，2008，72（3）： 778-785.

[14] DEMIRHAN E，APER D K，OZBEK B.Effect of hydrolysis products and Mg2+，Mn2+ and Ca2+ ions on whey laclose hydrolysis and β-galactosidase stability[J].J Chem Technol Biotechnol，2008，83（5）： 625-636.

[15] FLORES M V，ERTOLA R J，VOGET C E.Effect of monovalent cations on the stability and activity of Kluyveromyces lactis βgalactosidase[J].Food Sci Technol，1996，29（5）：503-506.

[16] YOKOYAMA K，NIO N，KIKUCHI Y.Properties and application of microbial transglutaminase[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，64（4）：447-454.