高效降解多菌灵芽孢杆菌菌株D—A—2的筛选及鉴定

马晨　王全

摘要[目的]筛选能高效降解多菌灵的菌株。[方法]对土壤中能高效降解多菌灵菌株D-A-2进行分离筛选及鉴定。[结果]采用管碟法从土壤中初筛得到24株具有活性的菌株，光谱法复筛得到6株降解能力较强的菌株，并对D-A-2菌株进行形态鉴定、生理生化特性鉴定和16S rDNA全序列分析。[结论]D-A-2菌株降解能力最强，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

关键词多菌灵；降解细菌；分离；鉴定；枯草芽孢杆菌

中图分类号S482.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）36-0135-02

Abstract[Objective]To screen the bacterial strains that can effectively degrade carbendazim.[Method]Carbendazimdegrading bacillus strain DA2 in the soil was isolated and identified.[Result] 24 strains with activity were obtained from the soil by cylinderplate method from the soil，6 strains with strong degrading ability were obtained by spectroscopic method.Morphological identification，physiological and biochemical characterization and sequence analysis of 16S rDNA analysis were carried out for strain DA2.[Conclusion]DA2 strain had the strongest degradation ability，which was initially characterized as Bacillus subtilis.

Key wordsCarbendazim；Degeneration bacterium；Isolation；Identification；Bacillus subtilis

多菌灵是农业生产中常用的一种苯并咪唑类杀虫剂，具有高效、低毒、广谱、内吸性等特点，能有效防治病虫害[1]。但多菌靈化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长[2]，造成了农田土壤和农产品污染。研究表明，多菌灵可引起肝病[3]，甚至导致染色体畸变[4]，对人体健康有着极大的危害。因此，研究如何降解土壤中的多菌灵具有一定意义。当前国内外已报道可以降解多菌灵的菌株有假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[5]、红球菌属（Rhodococcus sp.）[6-7] 、罗尔斯通氏菌（Ralstonia sp.）[8]、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[9] 和一株木霉菌株（Trichonderma sp.）等[10-11]。该试验筛选获得一系列降解多菌灵的菌株，根据其形态学特征、生理生化鉴定以及16S rDNA序列的分析，对菌株进行鉴定，以期为菌株的进一步研究和应用奠定科学基础。

1材料与方法

1.1土样与药剂试验土样来自于保定市周边被多菌灵污染的土样；多菌灵购自红日农化有限公司，浓度为80%。

1.2培养基参照沈萍等的《微生物学实验》[12]。

1.3生理生化鉴定及 16S r DNA 鉴定试剂生理生化鉴定试剂参照东秀珠等的《常见细菌系统鉴定手册》[13]；

16S r DNA 鉴定试剂参照奥斯伯的《精编分子生物学实验指南》[14]。

1.4降解菌分离和筛选

1.4.1土样采集。从保定市附近被多菌灵污染的农田土壤地表以下10～15 cm深处按5点取样法取样，各取50～100 g，做好标记。

1.4.2制备菌悬液。称取5 g土样放入45 mL无菌水中，充分混匀（用力振荡5 min）制得菌悬液。90 ℃水浴锅加热处理10 min，以富集产芽孢细菌。

1.4.3产芽孢细菌富集培养。取上述菌悬液5 mL接于配好的富集培养基（多菌灵浓度50 mg/L）中，30 ℃、180 r/min 培养48 h后，取3.0 mL新鲜的培养液转接到多菌灵浓度为100 mg/L的富集培养基中；30 ℃、 180 r/min培养48 h后，取3.0 mL新鲜的培养液转接到多菌灵浓度为200 mg/L的富集培养基中； 30 ℃、180 r/min培养48 h，混匀备用。

1.4.4菌株分离与筛选。取第3次富集培养液进行系列稀释，取10-4、10-5、10-6这3个稀释度的菌液各100 μL接于固体筛选培养基上，涂布均匀，30 ℃培养48～72 h至长出菌落。挑取平板上形态、颜色不同的菌落划线于NA平皿中检测纯度。纯化后编号并转接于NA斜面上30 ℃恒温培养24 h后4 ℃冰箱保存以备复筛。

1.4.5复筛。对初筛所得菌株，挑取少量斜面菌苔转接于多菌灵浓度为50 mg/L的无机盐培养基中，30 ℃、180 r/min培养48 h，过膜，除去菌体，于紫外分光光度计281 nm下测定上清液中农药残留量，以不加菌为空白对照。

1.5细菌鉴定方法

1.5.1形态鉴定。将细菌划线接种于NA平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落形态。参照东秀珠等[13]的方法进行革兰氏染色、芽孢染色，显微镜下观察其菌体形态。

1.5.2生理生化鉴定。参照《微生物学实验》《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》[12-13，15]上的方法对菌株进行生理生化鉴定，包括糖醇类发酵试验、淀粉水解试验、纤维素分解试验、产氨试验、脓青素产生试验、接触酶试验、荧光色素试验、柠檬酸盐利用试验、甲基红试验、丙二酸盐试验、脲酶试验、吲哚试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、3-酮基乳糖试验、V-P试验、反硝化试验、亚硝酸还原试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖氧化发酵试验、酯酶试验。

1.5.316S rDNA基因序列测序。

1.5.3.1提取基因组。活化细菌，培养10～12 h。取1 mL菌液，10 000 r/min离心10 min，弃去上清。加30 μL 0.05 mmol/L NaOH吹吸使菌体悬起来混匀。沸水浴15 min，10 000 r/min离心2～3 min，取上清即为DNA。将DNA放入冰箱，用时稀释10倍。

1.5.3.2PCR扩增。扩增体系为模板5.0 μL、E 0.2 μL、H2O 9.3 μL、Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、引物（1）0.5 μL、引物（2）0.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸80 s，35个循环；72 ℃ 延伸 30 min。

1.5.3.3电泳检测。制胶：（小板10孔）琼脂糖0.2 g+20 mL TAE，加热2 min。

点样：样品5 μL/孔+5 μL Buffer 混匀，点样后盖好，电泳30 min。

2结果与分析

2.1土样中降解菌分离筛选

采用管碟法初步筛选出24株具有降解活性的菌株，光谱法复筛得到6株活性较强的菌株，将其命名为D-A-1、D-A-2、D-A-3、D-A-4、D-A-5、D-A-6。

2.2多菌灵降解菌降解效率测定

通过测定求得多菌灵降解效率的标准曲线为y=0.038 0x+0.003 2，相关系数为0.999 4（图1）。

2.3菌株鉴定

2.3.1形态鉴定。通过对6株菌菌落形态的观察，初步判断均为细菌菌落，圆形或近圆形、污白色不透明、湿润、边缘不整齐，革兰氏阳性菌，有芽孢。

2.3.2生理生化试验结果。D-A-2菌株可以利用柠檬酸盐、丙二酸盐，能分解葡萄糖（但不能进一步产生酸代谢）、蔗糖、纤维素、含氮有机物、蛋白胨并生成吲哚，能水解淀粉，具有硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸脱氨酶、脲酶，可以进行反硝化，能产生荧光色素，有脓青素产生，不能分解乳糖，酯酶试验不产生晕圈，不是铜绿假单胞菌。

综合以上生理生化特性鉴定结果，对照《常见细菌系统鉴定手册》[13]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[15]，初步鉴定菌株 D-A-2属于芽孢杆菌属。

2.3.316S rDNA提取纯化及测序结果。对多菌灵降解效力最强的D-A-2进行了基因组DNA的提取纯化，电泳图谱如图2所示。

3结论与讨论

综上对筛选菌株的形态学及生理生化特征的研究，初步确定D-A-2分别为芽孢杆菌属，为确定种属，对D-A-2进行了16S rDNA基因测序，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，其在无机盐培养基中对多菌灵的降解率为4.00%。

接下来可以进一步确定此菌的降解效果以及降解机理，为投入实际应用奠定基础。

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