红球菌R04细胞分裂相关蛋白RHOGL008438对大肠杆菌细胞丝状化的影响

许晓潇,杨秀清

(山西大学 生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原 030006)

红球菌R04细胞分裂相关蛋白RHOGL008438对大肠杆菌细胞丝状化的影响

许晓潇,杨秀清*

(山西大学 生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原 030006)

通过转录组测序分析发现红球菌R04的RHOGL008438蛋白可能与细胞分裂有关。为研究其生理功能,通过构建融合表达质粒在大肠杆菌BL21中异源表达RHOGL008438蛋白,并在荧光显微镜下观察该蛋白对大肠杆菌细胞形态的影响。结果表明,过量表达RHOGL008438蛋白会使大肠杆菌细胞出现丝状化,丝状化程度与IPTG诱导浓度呈剂量效应关系,且培养时间越长,细胞丝状化程度越高。IPTG浓度为0.5 mmol/L时培养5 h后细胞长度可达46.2 μm,表明RHOGL008438蛋白干扰了大肠杆菌细胞隔膜的正常形成导致细胞丝状化。通过序列同源性分析,确定RHOGL008438蛋白为细胞分裂过程中的主要分裂蛋白FtsZ。

红球菌R04;细胞分裂蛋白;细菌细胞分裂;异源表达

细菌细胞分裂过程中,第一个分裂蛋白FtsZ定位于分裂位点并且聚合形成Z环,然后招募其他约20种分裂蛋白形成分裂小体[1-2],分裂小体随后收缩,拉动细胞膜以促进胞质分裂[3]。细胞分裂蛋白FtsZ是一种GTP酶,该酶的活性依赖于FtsZ蛋白的表达水平,FtsZ的N端被认为是对GTP依赖性聚合起重要作用的活性部位,而C端是FtsZ蛋白与其他细胞分裂蛋白相互作用的区域[4]。FtsZ蛋白在正常细菌细胞周期中发挥的作用是独一无二的,然而当FtsZ蛋白表达异常后如胞内浓度异常升高或降低,会使得细菌细胞分裂受阻,细菌细胞形态呈现丝状化[5]。ftsZ基因的序列与功能都是高度保守的,在细菌中仅存有一个拷贝[6]。

大肠杆菌细胞中其它分裂组分未改变时,FtsZ蛋白的过量表达会导致细胞分裂机制的不平衡,抑制细胞分裂[7]。将牙龈卟啉单胞菌的FtsZ蛋白在大肠杆菌中异源过表达后会导致大肠杆菌细胞形成丝状化[8];结核分枝杆菌FtsZ基因在其自身体内过量表达时,会使结核杆菌细胞丝状化[9];宿主根瘤菌中,同源或异源的FtsZ蛋白在过表达后会由于细胞壁向外生长时残留在细胞的中间位置而形成分支状结构[10];球状细菌如革兰氏阳性病原菌金黄色葡萄球菌中当FtsZ耗尽时细胞持续生长且不再分裂,会产生长的丝状细胞[11],最终细胞裂解。

红球菌(Rhodococcussp.)R04基因组与转录组测序结果注释为细胞分裂相关蛋白功能的基因RHOGL008438推测为ftsZ基因,我们从GenBank数据库中提取6条其他菌属的ftsZ基因序列,应用MEGA 5.0软件进行系统发育树分析(图1),结果表明红球菌R04 RHOGL008438基因序列与其他菌属ftsZ基因序列表现出极高的亲缘关系,与结核分枝杆菌的验证可信度达到100,由此可以说明该序列即为ftsZ基因序列。该基因的生理功能目前尚不清楚。我们课题组之前的研究发现,以联苯为唯一碳源培养红球菌R04时,其细胞会出现丝状化,且隔膜形成异常,通过实时荧光PCR方法检测RHOGL008438蛋白的表达情况,随着联苯浓度的增大,RHOGL008438蛋白的表达量下降(结果未显示),说明联苯影响了RHOGL008438蛋白的表达,进而影响了红球菌R04细胞的分裂。本研究为了证实RHOGL008438为细胞分裂相关基因,将其与pET-21a载体构建融合表达质粒,转化到大肠杆菌BL21细胞中,IPTG诱导表达后,在荧光显微镜下观察其对大肠杆菌细胞分裂的影响,以期确定RHOGL008438蛋白的生理功能。这对进一步研究红球菌R04细胞的分裂有着重要的意义。

注:Bootstrap验证次数为1 000;树枝上的数值为验证可信度;图左下端标尺表示碱基置换频率Fig.1 Phylogenetic tree of Rhodococcus sp. R04 RHOGL008438 gene sequence图1 红球菌R04 RHOGL008438基因序列系统发育树

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

实验所用的E.coliDH5a、E.coliBL21(DE3)、红球菌R04及载体pET-21a均由本实验室保存。所用培养基为LB培养基:5 g酵母膏,10 g胰蛋白胨,5 g氯化钠,加水定容至1 L。

1.2 主要试剂和仪器

FastPfu DNA Polymerase购于北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ,T4 DNA连接酶购于大连宝生物工程有限公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于上海生工生物工程有限公司;细胞膜染料FM1-43购于北京海德生物技术有限公司;日立UV-2010分光光度计(Hitachi Instruments公司);恒温震荡培养箱2HWY-200D(上海智城分析仪器制造有限公司)；Delta Vision Deconvolution microscope(美国Delta Vision公司)。

1.3 重组质粒的构建与鉴定

1.3.1 引物设计

根据RHOGL008438基因序列,通过Primer5.0软件设计引物,上游引物F:5′-TAGAATTCATGACGCCCCCGCACAACTACC-3′(EcoR Ⅰ);下游引物R:5′-TAAAGCTTTCAACGGCGCATGAAGATCGGC-3′(Hind Ⅲ),引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCR扩增目的基因

以红球菌R04基因组DNA为模板,扩增RHOGL008438基因,PCR反应条件:94℃ 5 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 60 s,30个循环,72℃ 10 min,获得目的基因DP,胶回收纯化PCR产物。

1.3.3 重组质粒构建和筛选

分别将基因DP与表达载体pET-21a通过限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ进行双酶切,酶切产物胶回收后在T4 DNA ligase的作用下16℃ 过夜连接,转化入E.coliDH5a感受态细胞中,在含有氨苄青霉素(终浓度为50 μg/mL)的LB平板上培养。通过菌落PCR筛选阳性重组质粒pET-21a-DP,Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切验证,送上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 RHOGL008438蛋白的表达

将测序成功的重组质粒pET-21a-DP转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,挑取单菌落接入含有氨苄青霉素(终浓度为50 μg/mL)的LB培养基中,37℃ 培养至OD600达到0.6时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,16℃,180 r/min恒温震荡过夜培养。8 000 r/min离心10 min收集菌体,Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L,pH 8.0)洗涤菌体,菌体重悬于缓冲液中。超声破碎菌体(间歇5 s,工作3 s,30个循环),12 000 r/min离心30 min,分别取全菌、上清和沉淀进行SDS-PAGE检测分析,经考马斯亮蓝染色与脱色后观察实验结果。

1.5 荧光显微镜观察

将pET-21a-DP和pET-21a分别转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,在含有氨苄青霉素(终浓度为50 μg/mL)的LB平板上培养,分别挑取单菌落于LB培养基中,37℃,180 r/min震荡培养。待生长至OD600达到0.6时分别加入终浓度为0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG进行诱导,16℃,180 r/min震荡培养,每个浓度做3个平行。上述培养的菌液,每隔1 h分别取样测量OD600值,同时进行膜染料FM1-43染色:取1 mL菌液,8 000 r/min离心5 min收集菌体,磷酸缓冲液(20 mmol/L,pH 8.0)洗涤菌体2次,膜染料FM1-43(终浓度为0.1 μg/mL)避光染色5 min,磷酸缓冲液洗涤2次,重悬于1 mL磷酸缓冲液中。取20 μL处理好的菌液滴于载玻片上,盖玻片直接压片,用玻璃纤维密封脂将盖玻片边缘密封。Delta Vision去卷积荧光显微镜下100倍物镜观察,激发波长为488 nm[12]。

1.6 数据分析

随机选取Delta Vision去卷积荧光显微镜下拍摄的图片,利用softworx explorer中长度测量工具测量大肠杆菌细胞的长度,每个样统计细胞数为100个,分别做3个平行。将所得数据导入Excel工作表中,统计不同细胞长度各占的百分比,所得数据均为平均数±标准偏差。利用Origin 9软件作图。

2 实验结果

2.1 目的基因的获得

以红球菌R04基因组为模板,通过PCR的方法扩增RHOGL008438基因,产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示。在1 200 bp处扩增出目的条带,与预期结果一致。

2.2 表达载体的构建和鉴定

用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ对重组质粒进行双酶切鉴定,结果如图3所示,3泳道中RHOGL008438基因条带与pET-21a载体分离,大小符合预期。测序结果表明，序列正确,重组质粒pET-21a-DP构建成功。

2.3 RHOGL008438蛋白的表达

重组质粒pET-21a-DP转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达,对菌体进行超声破碎后,分别对全菌、上清和沉淀进行SDS-PAGE检测分析,与诱导前相比,获得特异的新增表达条带,分子量大小符合预期,结果如图4所示,这表明RHOGL008438蛋白在大肠杆菌中成功表达。

注:M为100 bp DNA Ladder;1、2泳道均为RHOGL008438基因PCR扩增产物Fig.2 Products of RHOGL008438 gene图2 RHOGL008438基因的扩增

注:M为1 kb DNA Ladder;1、2和3泳道分别为疑似质粒双酶切结果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by digest图3 双酶切鉴定重组质粒

2.4 过量表达RHOGL008438蛋白对大肠杆菌细胞分裂的影响

2.4.1 过量表达RHOGL008438蛋白对大肠杆菌细胞形态的影响

注:M为蛋白分子量标准;泳道1-3分别为IPTG诱导后的全菌、上清、沉淀;泳道4-6分别为未诱导的全菌、上清、沉淀Fig.4 SDS-PAGE analysis of RHOGL008438 protein图4 RHOGL008438蛋白的SDS-PAGE分析

分别将重组质粒pET-21a-DP与空载体pET-21a转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经不同浓度的IPTG诱导,以未经IPTG诱导的大肠杆菌细胞作为对照,间隔取样,膜染料染色后Delta Vision荧光显微镜下观察大肠杆菌的细胞形态。含有pET-21a的大肠杆菌细胞在IPTG诱导前后其细胞形态是一致的(图5A和5B);未诱导的含有融合质粒的大肠杆菌细胞形态(图5C)与图5A和5B类似,而经IPTG诱导的大肠杆菌细胞形态变化很大(图5D-5F),表现为细胞长度的增加,形成丝状化,说明RHOGL008438蛋白的过表达对大肠杆菌的细胞分裂产生了影响,使其细胞出现丝状化。

注:A和B分别为含有pET-21a的大肠杆菌细胞IPTG诱导前与诱导后的形态;C-F均为含有pET-21a-DP的大肠杆菌细胞形态,其中,C:未经IPTG诱导;D:0.1 mmol/L IPTG诱导1 h;E:0.2 mmol/L IPTG诱导1 h;F:0.5 mmol/L IPTG诱导5 hFig.5 Fluorescence micrograph of E.coli cells图5 大肠杆菌细胞的荧光显微镜图

2.4.2 不同浓度IPTG诱导下大肠杆菌细胞长度百分比

为了研究红球菌R04的RHOGL008438蛋白对大肠杆菌细胞分裂的影响,分别加入终浓度为0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG对转入重组质粒pET-21a-DP的大肠杆菌细胞进行诱导培养,间隔1 h进行取样, Delta Vision荧光显微镜下观察,测量统计不同细胞长度所占的百分比。由图6可以看出IPTG诱导RHOGL008438蛋白表达影响了宿主大肠杆菌的细胞形态,使菌体呈现丝状化,细胞长度随着IPTG诱导时间的延长而增大,同时IPTG诱导浓度增大,细胞长度也随之增大。IPTG浓度为0.1 mmol/L时,培养1 h后细胞长度为2～6 μm；当培养2 h后,细胞长度达18～22 μm；3 h后细胞长度最大可达到26～30 μm；培养4～5 h后，细胞长度可达30～34 μm(图6A)。当IPTG浓度增大到0.5 mmol/L时(图6E),培养2 h时最长细胞长度为34～38 μm,培养5 h后细胞长度最长可达46～50 μm。

虽然在不同IPTG诱导浓度不同培养时间下最大细胞长度不尽相同,但不同IPTG诱导浓度下培养1 h后所占比例最大的细胞长度范围基本一致,均为2～6 μm;诱导2 h后,IPTG浓度为0.1～0.3 mmol/L时,所占比例最大的细胞长度范围仍为2～6 μm,而IPTG浓度为0.4～0.5 mmol/L时所占比例最大的细胞长度范围为6～10 μm;诱导3～4 h,不同IPTG诱导浓度下所占比例最大的细胞长度范围仍为6～10 μm;诱导培养5 h后,IPTG浓度为0.2～0.5 mmol/L所占比例最大的细胞长度范围保持不变,而IPTG浓度为0.1 mmol/L时,所占比例最大的细胞长度范围变为2～6 μm。通过跟踪测量诱导表达了RHOGL008438蛋白的大肠杆菌生物量,发现培养19 h时的OD600值与培养2 h时相当(数据未显示),说明RHOGL008438蛋白过表达会抑制大肠杆菌细胞的生长分裂,且随着诱导浓度的增大抑制率增大,菌体不断增长,最终导致丝状化的细胞裂解死亡。

注:A:IPTG浓度为0.1 mmol/L;B:IPTG浓度为0.2 mmol/L;C:IPTG浓度为0.3 mmol/L;D:IPTG浓度为0.4 mmol/L;E:IPTG浓度为0.5 mmol/LFig.6 The percentage of cell length on the different time of different concentration with IPTG图6 不同IPTG浓度诱导下不同时期细胞长度百分比

红球菌R04基因组与转录组测序结果注释为细胞分裂相关蛋白功能的基因RHOGL008438推测为ftsZ,本研究将其与pET-21a载体构建融合表达质粒,转化到大肠杆菌BL21细胞中经IPTG诱导表达,结果显示对大肠杆菌细胞的分裂造成了影响,证实RHOGL008438为细胞分裂相关蛋白,通过对不同IPTG诱导浓度下不同时期的细胞长度进行测量统计,说明大肠杆菌细胞隔膜的形成受到干扰,基于序列同源性分析,表明RHOGL008438蛋白确实为细胞分裂过程中主要的分裂蛋白FtsZ。

3 讨论

红球菌R04,是需氧的革兰氏阳性细菌,和分枝杆菌同属于放线菌[13]。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单。为了构建高纯度的RHOGL008438重组蛋白分离纯化体系,探讨其生理功能,本研究利用大肠杆菌BL21 异源表达红球菌R04 RHOGL008438重组蛋白[14]。融合表达质粒pET-21a-DP转入大肠杆菌细胞中诱导表达后,大肠杆菌细胞形态异常,细胞出现丝状化,随着IPTG诱导浓度的加大,丝状化程度增大,表明RHOGL008438蛋白的过量表达干扰了大肠杆菌细胞隔膜的形成,对宿主大肠杆菌的细胞分裂造成了影响,引起细胞丝状化。研究报道,将牙龈卟啉单胞菌的FtsZ蛋白在大肠杆菌中过表达后导致了大肠杆菌细胞丝状化[8],细胞伸长约20倍,说明牙龈卟啉单胞菌的FtsZ蛋白可以干扰大肠杆菌细胞隔膜的形成,这与本研究的结果一致,表明RHOGL008438蛋白为细胞分裂相关蛋白,其生理功能与隔膜形成有关。

有关大肠杆菌细胞丝状化的研究报道主要集中在对FtsZ蛋白的抑制方面。当FtsZ的GTP酶活性受到阻碍时对其FtsZ浓度会造成一定的影响,FtsZ的浓度影响细胞分裂的进行[15]。有报道指出多环生物碱中的血根碱通过减少FtsZ的聚合来抑制FtsZ原丝组装,进而抑制FtsZ蛋白[16]。生物碱中的小檗碱也可通过抑制GTP酶活性和降低FtsZ聚合抑制FtsZ蛋白[17]。在一些革兰氏阴性菌中存在抑制FtsZ蛋白的SOS途径,SulA蛋白参与SOS途径,以1∶1的比例结合FtsZ单体,以减少FtsZ在细胞内的有效浓度,通过抑制FtsZ在分裂位点的聚合从而引起细胞丝状化[18-19]。RHOGL008438蛋白过表达阻碍宿主大肠杆菌的细胞分裂而形成丝状化菌体这一过程的机制需要进一步研究。

本研究通过将RHOGL008438蛋白在大肠杆菌BL21细胞中诱导表达后观察其对大肠杆菌细胞分裂的影响,证实RHOGL008438为细胞分裂相关基因,该基因功能与隔膜形成有关,这为进一步研究红球菌R04细胞的分裂提供依据,为研究FtsZ蛋白作为抗菌药物的新靶点提供基础。

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Effect ofRhodococcussp. R04 Cell-division-related Protein RHOGL008438 on the Filaments Formation ofEscherichiacoli

XU Xiaoxiao,YANG Xiuqing*

(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education,Institute of biotechnology,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Transcriptomics analysis indicated that the protein RHOGL008438 ofRhodococcussp. R04 may be related to cell division. The heterologous expression of RHOGL008438 inEscherichiacoliBL21 was performed to find out its physiological function on cellular morphology by fluorescence microscope.The results showed that the filamentous cells were formed. There was a significant correlation between cell filamentous and IPTG concentration. The longer the culture time was, the longer the filamentous was. The cell length ofE.coliwas reached 46.2 μm after 5 h under 0.5 mmol/L IPTG. The results revealed that RHOGL008438 inhibited the formation of septum ofE.coli, and confirmed it played a significant role in cell division. RHOGL008438 was then identified as cell-division-related protein FtsZ by sequence homology analysis.Key words：Rhodococcussp. R04;cell division protein;bacterial cell division;heterologous expression

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.027

2017-03-01；

2017-03-09

山西省自然科学基金(2014011030-3);山西省煤层气联合研究基金(2015012002);山西省煤基重点科技攻关项目(MQ2014-03)

许晓潇(1992-),女,硕士研究生,研究方向为微生物生物转化与生物催化。

*通信作者：杨秀清(YANG Xiuqing),E-mail:xiuqyang@sxu.edu.cn

Q93;Q25

A

0253-2395(2017)02-0373-07