八肋游仆虫ARF1蛋白的表达纯化及其与嘌呤核苷酸的相互作用

2017-05-25赵雪梅宋建英王茜王软林杨斌盛梁爱华

山西大学学报（自然科学版） 2017年2期

赵雪梅,宋建英,王茜,王软林,杨斌盛,梁爱华*

(1.山西大学生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,太原 030006;2.山西大学分子科学研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,太原 030006)

赵雪梅1,宋建英1,王茜1,王软林1,杨斌盛2,梁爱华1*

ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成员,调控细胞内囊泡运输,进而影响细胞的生长发育。为了研究单细胞真核生物八肋游仆虫ARF1的功能,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,在大肠杆菌BL21中进行了表达纯化,获得高纯度的八肋游仆虫腺苷酸核糖基化因子1蛋白EoARF1,随后通过荧光光谱法检测了其与嘌呤核苷酸的相互作用。结果表明,表达纯化的EoARF1蛋白能与嘌呤核苷酸发生相互作用,其结合位点数n约等于1,且与鸟嘌呤核苷酸作用强弱顺序为GTP>GDP>GMP,与GDP的结合强度明显大于与ADP的结合强度。

ADP核糖基化因子1;八肋游仆虫;表达纯化;荧光光谱法

细胞内的物质转运对于细胞的生存和生长至关重要,真核细胞大分子与颗粒性物质的跨膜运输是通过将它们包裹在脂双层膜围绕的囊泡中进行转运[1]。囊泡转运受多种调节分子控制,其中就有ADP核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1, 简称ARF1)[2]。ARF1蛋白是肉豆蔻酰基化的小鸟嘌呤核苷结合蛋白家族中的一员,是霍乱毒素的变构激活剂,主要参与网格状蛋白和无网格状蛋白两种囊泡被膜的形成,并进一步调控囊泡运输,参与细胞内物质运输[3-4]。与其他GTPase一样,当它结合GDP成为失活态,结合GTP时被激活成活化态,活化后的ARF1与下游效应分子相互作用形成运输囊泡,主要是通过调节鸟嘌呤核苷置换因子(GEFs)、BFA和GTP酶活化蛋白(GAPs)来进行调节[5-10]。而GAP 能水解ARF1上的GTP,促使这两种囊泡的被膜和膜解离,从而囊泡和目的细胞器的膜最终融合[11]。这样囊泡可在内质网和高尔基复合体之间运输多种细胞内物质。人的 ARF1(hARF1)由181个氨基酸组成,含有ARF家族中与GTP结合与水解的结构域(GX4GK, DVGG, NKQD, CAT)和N末端作为十四烷基化位点高度保守的第二位甘氨酸[12-13]。有文献报道,利用大肠杆菌表达系统表达获得的重组hARF1能够在体外与GDP/ADP相互作用,与GDP的结合强度大于与ADP的结合[14]。

纤毛虫是一类结构复杂的单细胞原生动物,有两种大小不同的核,一种是二倍体的小核,负责基因重组,另一种是多倍体的大核,负责调控细胞生长发育。这类生物体内各细胞器之间囊泡运输系统极为完善。本课题组前期对八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)的小分子GTP酶Rab蛋白家族进行了基因克隆,并在体内研究了部分Rab蛋白的定位和功能[15]，然而对游仆虫中ARF家族成员在膜泡运输过程中的功能了解甚少。为了研究游仆虫ARF1的性质与功能,克隆了八肋游仆虫的ARF1基因,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,在大肠杆菌中进行了表达纯化,获得了高纯度的八肋游仆虫ARF1(EoARF1),表达产物经Western blot检测为阳性,通过荧光光谱技术检测了EoARF1蛋白与嘌呤核苷酸之间的相互作用,为进一步研究EoARF1蛋白的功能奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

1.1.2 菌株和质粒

八肋游仆虫由本课题组通过绿藻培养;菌株E.coliDH5α,E.coliBL21(DE3) 由本实验室保存;表达载体pET-28a(+)购于Novagen公司,其中含有T7启动子和6×His标签,带有卡那霉素(Kanamycin)抗性;PCR引物由Sangon Biotech公司合成;DNA测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.1.3 试剂

质粒小量提取试剂盒,胶回收试剂盒购于TIANGEN公司,DNA Taq聚合酶、Trans2k PlusⅡ DNA Marker购于全式金生物技术有限公司;限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于TaKara公司;GDP-2Na和ADP-2Na、GTP-3Na、GMP-2Na购于Sangon Biotech公司,HisTrap FF 5 mL预装柱和SuperdexTM75 凝胶层析柱购于GE Healthcare公司;其他常用试剂均购于Sangon Biotech公司。

1.2 实验方法

1.2.1EoARF1基因的克隆

根据八肋游仆虫的基因组转录组数据,设计EoARF1基因特异性引物,上游引物:5’-CGGGATCCATGGGATTTGTGTTTTC-3’;下游引物:5’-ACGCGTCGACTTTCAAGAATTTACTTT-3’;分别以游仆虫基因组和cDNA为模板进行PCR扩增(95℃变性5 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30循环后72℃延伸5 min, 得到EoARF1扩增产物。与克隆载体pMD®18-T过夜连接后,转入大肠杆菌DH5α中,筛选获得阳性克隆,提取pMD®18-EoARF1质粒后交由公司测序鉴定。

1.2.2 pET28a-ARF1-T重组表达质粒的构建

以质粒pMD®18-EoARF1为模板,利用上述EoARF1特异性引物进行PCR,将纯化的PCR产物与表达载体pET28a均用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ分别进行酶切并进行胶回收,然后利用T4 DNA连接酶16℃过夜连接。将连接产物转化于大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂在含35 μg/mL 卡那抗性的LB平板上。次日选取阳性转化子进行菌液PCR初步筛选,随后进行质粒提取,用BamHⅠ和SalⅠ对质粒进行双酶切鉴定后,送北京华大基因公司测序验证获得pET28a-ARF1。

为使EoARF1基因能在大肠杆菌中表达,设计了定点突变引物将328位的苯丙氨酸(T)删除使其能够顺利通读,上游引物:5’-GTTAGTCAACTAGAATTCTTTAACCTTATCCTT-3’;下游引物:TTCAGAATTAAGGATAAGGTTAAAGAATTC;以质粒pET28a-ARF1为模板,进行PCR突变,取8 μL PCR产物加入0.5 μLDpnⅠ和2 μL Buffer,37℃过夜消化后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,在含有卡那抗性的LB固体平板培养基上37℃倒置培养约16 h,挑取单菌落于5 mL LB液体培养基中过夜培养,提取质粒pET28a-ARF1-T,交由公司测序鉴定。

1.2.3 EoARF1重组蛋白的表达纯化

将测序正确的重组质粒pET28a-ARF1-T转化于大肠杆菌BL21感受态细胞中,涂布在含有卡那抗性的LB平板上,37℃恒温过夜培养。挑取单菌落至5 mL含卡那抗性的LB液体培养基中过夜培养,次日将菌液按1∶100的比例扩大接种至500 mL含有卡那抗性的LB培养基中,37℃培养至OD600达到0.4-0.6,加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L,37℃诱导5 h后,8 000 r/mim,4℃离心10 min收集菌体。然后用40 mL缓冲液(20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)进行悬洗,置于冰浴中进行超声破碎至无明显菌体,13 000 r/min离心20 min,收集上清,将上清蛋白加入已用平衡缓冲液 (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)平衡好的镍柱中,置于4℃摇床结合 2 h;利用洗涤缓冲液 (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑,pH 8.0)对非特异结合的蛋白进行洗涤;最后再用洗脱缓冲液 (浓度梯度咪唑,pH 8.0) 将目的蛋白进行洗脱;合并洗脱液,利用10 kD 的浓缩管将目的蛋白通过4℃,3 000 r/mim条件进行浓缩至1 mL,将浓缩蛋白利用0.22 μm滤膜进行过滤后,上样于用缓冲液 (50 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L NaCl, pH 7.4)平衡好的 SuperdexTM75 凝胶层析柱, 以达到进一步纯化的目的。将纯化的目的蛋白经 15% SDS-PAGE检测,并将浓缩后的蛋白经酶标仪检测浓度后,于-80℃保存备用。

1.2.4 EoARF1重组蛋白的Western Blot检测

将目的蛋白经15% SDS-PAGE分离后,剪同样大小的两张滤纸和PVDF膜,将PVDF膜放置于甲醇中,进行活化20 s后,在蒸馏水中清洗2 min,置于转膜仪中,90 V恒压冰浴转膜90 min,转膜结束后将PVDF膜置于脱脂牛奶封闭液中封闭1 h,利用anti-His抗体4℃孵育过夜(1∶1 500稀释),PBST中清洗3-5次后,羊抗鼠荧光二抗(1∶10 000稀释)4℃孵育1 h,PBST中清洗5次后经Odyssey Family双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)扫膜成像。

1.2.5 荧光光谱法测定EoARF1蛋白与嘌呤核苷酸的相互作用

采用荧光光谱法测定EoARF1蛋白与嘌呤核苷酸GMP/GDP/GTP以及ADP的相互作用[14]。蛋白质因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸残基而能发射较强的内源荧光,在270～300 nm的紫外光照射下发出荧光,当测定体系中加入小分子配体时,配体和蛋白质发生弱相互作用,会导致蛋白质荧光的静态淬灭。利用这个现象,可以确定蛋白质与配体的作用类型以及其结合部位等[16-17]。

将EoARF1纯化蛋白用缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)调节至终浓度为1.25 μmol/L。取2 mL置于4 mL石英比色皿中,随后利用10 mmol/L GDP溶液进行荧光滴定(累积滴定1、2、4、8、16 μL等等),直到荧光强度稳定为止。在每次滴加GDP溶液结束后搅拌均匀,稳定2 min后,进行荧光光谱变化的测量。设定测试条件:室温下 (25℃),激发波长280 nm,扫描波长300～450 nm,狭缝宽度激发状态为4.0 nm,发射状态为5.0 nm,扫描速率300 nm/min。在同等条件下,分别利用 10 mmol/L 的GMP/GTP/ADP溶液取代GDP溶液重复以上实验。

2 结果与分析

2.1 八肋游仆虫ARF1基因克隆、序列分析及重组质粒pET28a-ARF1的构建

序列分析表明,游仆虫ARF1基因编码区全长 565 bp,无内含子。编码区有两个开放阅读框,第一个读框编码ARF1的前109个氨基酸,而从328 bp起的第二个开放读框编码ARF1剩余的78个氨基酸。该基因序列已经提交GanBank,登录号为KU981055。分析后初步确定这个基因是游仆虫中的一个+1位的编程性移码基因,两个读框的衔接处是TTTTAAC,属于一个新的七核苷酸滑动序列类型[18],两个读框编码的完整游仆虫ARF与人的ARF1序列同源性为 45.9%。含有与 GTP结合与解离相关的四个结构域(见讨论)。

以pMD®18-EoARF1质粒为模板,利用上下游引物扩增EoARF1基因,将其克隆到表达载体pET28a(+)中,通过双酶切鉴定以及测序证实重组质粒pET28a-ARF1构建成功。为了使这个基因能够在大肠杆菌中得到表达,通过定点突变将七核苷酸滑动序列TTTTAAC变为TTTAAC(图1),以保证产生结构域完整的EoARF1。

Fig.1 Partial sequences before (A) and after (B) site-directed mutation of EoARF1 gene图1 EoARF1基因的定点突变前(A)后(B)的序列

2.2 EoARF1重组蛋白的表达纯化

将重组表达质粒pET28a-ARF1-T转化至大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物通过15% SDS-PAGE分析,在分子量约为25 kD左右出现一条诱导表达蛋白条带,并且该表达产物存在于上清液中,而在未经IPTG诱导的工程菌中无此条带,将上清液中的目的蛋白通过亲和层析进行纯化,SDS-PAGE中显示为单一条带(图2A,泳道3-5),Western印迹分析表明,可溶性的EoARF1 蛋白可与anti-His 抗体特异性反应(图2B)。随后对目的蛋白又进行了SuperdexTM75 凝胶柱层析纯化(图2C),SDS-PAGE分析表明蛋白达到了电泳纯(图2D)。

A: SDS-PAGE analysis of expressed product. Lane 1: whole cell lysate of E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1;Lane 2:Supernatant of E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1; Lane 3-5: protein fraction from the Ni-column eluted with 50 mmol/L, 100 mmol/L and 150 mmol/L imidazole; B: Western blot of pET28a-ARF1;C: Gel filtration chromatography of the EoARF1; D: SDS-PAGE analysis of purified EoARF1 protein.Lane M: Low molecular weight markerFig.2 Expression and purification of pET28a-ARF1A: 表达产物的SDS-PAGE图。Lane 1:E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1全菌;Lane 2:E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1上清;Lane 3-5;不同浓度咪唑洗脱样品;B: pET28a-ARF1 的Western 印迹分析;C: ARF1蛋白经凝胶柱纯化的洗脱图;D:SuperdexTM75 凝胶柱层析纯化后的EoARF1的SDS-PAGE图。 Lane M: 低分子量标准蛋白图2 pET28a-ARF1的表达纯化

2.3 EoARF1蛋白与嘌呤核苷酸相互作用的荧光光谱分析

为了探究表达的EoARF1是否具有与嘌呤核苷酸的结合活性,采用荧光光谱法[14]。EoARF1蛋白编码181个氨基酸,其内源荧光来自于分子中的色氨酸(W66,W78,W153,W172)和酪氨酸(Y35,Y81,Y91)。将EoARF1蛋白浓度固定后,随着鸟嘌呤GMP/GDP/GTP或者腺嘌呤ADP浓度的增加,EoARF1蛋白的内源荧光强度降低,不同浓度的嘌呤核苷酸导致EoARF1蛋白的荧光猝灭结果见图3。

EoARF1蛋白与嘌呤核苷酸形成复合物引起荧光猝灭,二者的结合可用荧光物质-猝灭分子间的结合常数表达式lg{[F0-F]/F}=lgK+nlg[Q]进行计算[19],求得结合常数以及结合位点数(表 1)。

A:Fluorescence spectroscopies of the addition GMP to EoARF1. B:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGMP of EoARF1. C: Fluorescence spectroscopies of the addition GDP to EoARF1.D:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGDP of EoARF1.E: Fluorescence spectroscopies of the addition GTP to EoARF1. F:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGTP of EoARF1.G:Fluorescence spectroscopies of the addition ADP to EoARF1.H:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgADP of EoARF1Fig.3 Fluorescence quenching by the addition GMP/GDP/GTP/ADP to EoARF1 A:GMP滴定EoARF1的荧光光谱;B: lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}对lgGMP作图。 C: GDP滴定EoARF1的荧光光谱;D: lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}对lgGDP作图。 E: GTP滴定EoARF1的荧光光谱;F:lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}对lgGTP作图。 G: ADP滴定EoARF1的荧光光谱;H:lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}对lgADP作图。图3 以GMP/GDP/GTP/ADP滴定EoARF1的荧光淬灭图

嘌呤核苷酸结合常数(Ka)结合位点数(n)相关系数(R)GMP4.53×103mol-0.8320.8320.9985GDP6.82×103mol-0.9030.9030.9985GTP7.06×103mol-0.8790.8790.9884ADP1.88×103mol-0.7780.7780.9950

表1结果显示,表达纯化的EoARF1蛋白能够与嘌呤核苷酸相互作用,且结合位点数n≈1,与GMP、GDP和GTP的结合常数分别为4.53×103mol-、6.82×103mol-、7.06×103mol-,表明其与鸟嘌呤核苷酸作用强弱顺序为GTP>GDP>GMP,此外与ADP的结合常数为1.88×103mol-,表明EoARF1蛋白与GDP的结合强度大于与ADP的结合,与重组hARF1与嘌呤核苷酸结合性质一致[14]。

3 讨论

真核细胞中许多大分子物质的运输需要通过囊泡转运完成,其中COP I(coat protein I)型囊泡主要介导内质网和高尔基体之间和高尔基体内部的转运过程[20],ARF1蛋白是COPⅠ包被的囊泡运输中重要的调节蛋白。ARF1在GDP结合型和GTP结合型两种构象间循环,当它与GDP结合时为非活性状态,位于胞质中,而与GTP结合时为活性状态,可以锚定在膜上,这种状态的ARF1能够启动COPⅠ囊泡的形成[21]。本研究主要将单细胞真核生物八肋游仆虫的ARF1基因在大肠杆菌BL21中进行了表达纯化,得到高纯度的重组蛋白,利用光谱学手段研究了重组EoARF1蛋白与嘌呤核苷酸的相互作用。

Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequence of ARF1 from different organisms.The blue box shows the conserved motif involved in GTP dissociation.The red boxes show the conserved motifs involved in GTP binding.The red triangle indicates G2, the site of N-terminal myristoylation afterco-translational removal of methionine.The red asterisks indicate the frameshift region图4 八肋游仆虫ARF1与其他生物的ARF1的氨基酸序列比对图。蓝色方框标注的是保守的GTP解离结构域,红色方框标注的是保守的GTP结合结构域,红色三角形标注的是N末端十四烷基化位点G2,红色星号标注的是移码位点

分析八肋游仆虫ARF1基因序列时发现,该基因是一个编程性核糖体移码基因(programmed ribosomal frameshift, PRF),编程性核糖体移码是指翻译中的核糖体在mRNA上的特定位置,从起始的0读框转换到+1或-1读框,然后继续翻译的现象[22],目前已经在多种生物中发现这种现象的存在。编程性核糖体移码是在翻译水平上的一种基因表达调控方式。本实验室通过基因组转录组研究发现,八肋游仆虫中存在高频率的编程性核糖体移码现象[18]。八肋游仆虫的ARF1基因移码位点位于距翻译起始109氨基酸残基处,对应的氨基酸序列为107-EFFN-110 (图4,星号表示),如果不发生移码,只能形成一个截短蛋白。有文献报道,利用分子对接法表明重组hARF1蛋白与嘌呤核苷酸的结合位点位于高度保守的GDP结合区域(126-NKQD-129),且GDP能通过与TCAT结构域(158-TCAT-161)的相互作用来增加其稳定性,其中Ala-160与鸟嘌呤碱基形成氢键[14]。该分子对接结果提示,这种相互作用既有嘌呤核苷酸分子中磷酸基团的参与,也有碱基的作用[14]。八肋游仆虫ARF1与鸟嘌呤核苷酸作用的荧光光谱结果显示其结合强弱顺序为GTP>GDP>GMP,体现了磷酸基团在结合中的重要性；同时,当比较鸟嘌呤核苷酸GDP以及腺嘌呤核苷酸ADP与EoARF1结合常数时,表明EoARF1蛋白与GDP的结合强度大于与ADP的结合,体现了碱基在相互作用中的重要性。因此,本研究从实验上支持了利用hARF1与嘌呤核苷酸分子对接结果。

比较八肋游仆虫ARF1与其他生物的ARF1氨基酸序列发现,游仆虫的ARF1序列中也同样含有保守氨基酸序列NKXD(图4,见红色方框),然而这个结构域在移码位点之后。如果这个基因在游仆虫体内是有功能的,在蛋白质翻译时必须通过一次+1移码产生一个包括NKXD结构域的完整蛋白,才能与GDP结合,发挥其囊泡运输的调节功能。游仆虫ARF1的TCAT相应结构域处是CCAL(图4,红色方框),保守的Ala氨基酸可与鸟嘌呤形成氢键,增强了鸟嘌呤与ARF1结合的稳定性。本研究为后续游仆虫ARF1特异性抗体制备提供了实验材料,同时也为游仆虫编程性核糖体移码机制的研究提供了新思路。

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Expression and Purification of a Recombinant ARF1 ofEuplotesoctocarinatusand Its Interaction with Purine Nucleotides

ZHAO Xuemei1,SONG Jianying1,WANG Xi1,WANG Ruanlin1,YANG Binsheng2,LIANG Aihua1*

(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006,China;2.Institute of Moleculat Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

ADP ribosylation factor 1 (ARF1) is a member of the Ras superfamily, which regulate the intracellular vesicle transport and thereby affect the cell growth and development. In order to study the function of ARF1 fromEuplotesoctocarinatus, a recombinant plasmid pET28a-ARF1 was constructed and expressed inE.coliBL21. High purity of EoARF1 was obtained. The interaction between EoARF1 with purine nucleotides was investigated by using fluorescence spectroscope. The results showed that the EoARF1 protein could interact with purine nucleotides, the binding site value was nearly one and the intensity of the interaction with guanine nucleotides was GTP>GDP>GMP. In addition, the binding constant indicated that the interaction between EoARF1 and GDP was stronger than that of ADP.

ADP ribosylation factor 1;Euplotesoctocarinatus;expression and purification;fluorescent spectrometry

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.026

2016-12-22；

2017-02-17

国家自然科学基金(31372199；31272100)

赵雪梅(1990-)，女，山西朔州人，硕士研究生，研究方向为原生动物细胞分子生物学。E-mail:464391230@qq.com

*通信作者：梁爱华(LIANG Aihua),E-mail:aliang@sxu.edu.cn

Q74

0253-2395(2017)02-0365-08