热处理对菠菜和上海青类囊体膜及叶绿素稳定性的影响

樊昶昶，熊新星，邹亚红，于昊永，张 燕

(中国农业大学食品科学与营养工程学院/国家果蔬加工工程技术研究中心，北京 100083)

热处理对菠菜和上海青类囊体膜及叶绿素稳定性的影响

樊昶昶，熊新星，邹亚红，于昊永，张 燕

(中国农业大学食品科学与营养工程学院/国家果蔬加工工程技术研究中心，北京 100083)

绿色蔬菜在加工和贮藏过程中发生的颜色劣变与类囊体膜上叶绿素蛋白复合体的稳定性有着密切的关系。本研究以上海青和菠菜为原料，研究了两种绿色蔬菜在热处理过程中类囊体膜溶液热容、多肽组分、叶绿素含量、pH以及蛋白质荧光的变化。结果表明：热处理会导致叶绿素蛋白复合体的降解，类囊体膜溶液pH下降，上海青类囊体膜热稳定性、叶绿素含量的保持优于菠菜类囊体膜。试验结果为我们明确绿色蔬菜颜色劣变的机理以及寻求更好的护绿手段提供了理论基础。

类囊体膜；叶绿素蛋白复合体；热稳定性；叶绿素

绿色是展示绿色蔬菜及其制品品质的重要指标，但绿色蔬菜加工和贮藏过程中通常会发生严重的颜色劣变，严重影响外观和消费者的接受度，不利于影响着绿色蔬菜加工产业的发展。因此，探索合适的技术延缓加工绿色蔬菜的颜色劣变就显得极为重要。但在此之前需要明确绿色蔬菜颜色劣变的机理。目前，绿色蔬菜颜色劣变主要归咎于叶绿素的降解，并认为叶绿素的降解途径主要有两条：由外界环境如温度和酸主导的降解途径，这一过程大多存在于经过一定加工的绿色蔬菜中[1]；另一条是由叶绿素酶和脱镁叶绿素螯合酶主导的代谢途径，这个途径通常发生在衰老的植物叶片中[2]。

针对目前加工绿色蔬菜中存在的颜色劣变问题，较为常用的护绿策略为：采用叶绿素铜钠或叶绿素锌钠进行染色[3]、调节pH值护绿[4-5]、热烫[4，6-7]、UV-B辐照等杀灭、钝化酶活，控制酶主导的叶绿素降解[8]，加入抗氧化剂，抑制酶活，应用ZnCl2、CuCl2金属离子[4，9]可有效提高热加工绿色蔬菜的颜色。由此可见，对于加工绿色蔬菜颜色控制的策略和方法，仍然集中于对叶绿素降解的控制，但增效多不明显。

多年来，附于类囊体膜上的叶绿素蛋白复合体是调控绿色劣变的根本，这一实质问题没有被广泛关注。经过加工的绿色蔬菜，类囊体膜不同程度受损，叶绿素蛋白复合体降解，从而释放出游离的叶绿素，叶绿素进一步被降解，才导致加工绿色蔬菜最终的颜色劣变。为了寻找更加合适的调控绿色蔬菜颜色劣变的方法，提高加工绿色蔬菜制品品质，本文以叶绿素蛋白复合体是稳定绿色的根本这一观点出发，研究热处理对不同蔬菜的类囊体膜和叶绿素的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

购于农贸市场的新鲜上海青以及菠菜，洗净沥干后，参考卢然[10]、王蓉蓉[11]的方法，置于4 ℃冷库中进行预冷处理，大约1h后取出预冷的叶片进行类囊体膜的提取，得到类囊体膜制备液，而后进行水浴加热处理。控制水浴锅升温速率为10℃/10min，升温范围为20～90℃，在温度上升至30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃时依次取出样品并以温度为标记编号。

1.2 试验仪器与设备

2000 D型超纯水器，北京长风仪器仪表公司；S-HH-W21-Cr600型恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂；KQ-250DE型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；差式扫描微量热仪Nano DSC，美国TA公司；安捷伦1260c型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Varian Cary Eclipse型荧光分光光度计，美国安捷伦公司；YP11/TN-EPS 300型电泳仪，北京中西远大科技有限公司；MODEL868型pH计，美国奥立龙公司；BS223S型电子天平，德国Sartorious公司；CR21GIIIHITACHI型高速冷冻离心机，日立集团；EY-300A型分析天平，日本松下电器公司；JYL-610型九阳打浆机，九阳股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 类囊体膜热容测定 参照Cramer等[12]的方法，类囊体膜溶液放置在铝坩埚中，升温范围为25～120℃，升温速率为 1 ℃/min。使用差示扫描微量热仪测定上海青及菠菜的类囊体膜溶液摩尔热容的变化。

1.3.2 类囊体膜多肽组分测定 参照韦司棋[13]的方法，取出经热处理的类囊体膜溶液，每个样品取出20 μL类囊体膜溶液，加入等体积2×蛋白上样缓冲液，涡旋混匀，于100℃的沸水中变性5 min，冷却后在12 000 g条件下离心5 min，取上清液点样，再加电极缓冲液，当指示剂到达板前2 cm完毕，取出胶放在水中10 min，然后放入到配置好的染色液中，染色0.5～1 h，用水洗2～3次，再加入脱色液脱色10 min，进行3次后，放到摇床上，待条带清晰背景清晰时，可采用凝胶成像系统进行摄影。

1.3.3 叶绿素含量测定 用50 μL的加热过后的类囊体膜溶液，再加入0.95 mL的甲醇，再用0.22 μm的针孔滤膜过滤，装于液相小瓶之中。方法参照Teng & Chen[14]，色谱柱选用Cosmosil 5C18-AR-II(NACALAITESQUE，INC，5μm，4.6mm UEAR-II)，流动相：乙腈：甲醇：三氯甲烷：正己烷=75∶12.5∶7.5∶7.5(v/v/v/v)，柱温为30℃，流速为1 mL/min，等度洗脱，检测波长为430 nm，进样量为20 μL。

1.3.4 类囊体膜溶液pH测定 使用pH计测定加热过程中的上海青和菠菜的类囊体膜溶液的pH值，待稳定后记下读数，每个点重复测定3次。

1.3.5 类囊体膜溶液的蛋白质荧光测定 类囊体膜溶液的蛋白荧光采用Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer 仪器进行测定。取40 g鲜重叶片制备出的类囊体膜溶液10 mL，进行加热处理，处理之后，每个样品取8 μL溶解于1 mL的A液中。以278 nm波长的光激发，检测300～400 nm处的发射光谱。

2 结果与分析

2.1 类囊体膜热容变化

差示扫描量热仪可用于研究生物膜结构和功能、蛋白质和核酸构象变化。热容的变化能够反映样品中蛋白质的热稳定性，热容变化越大说明蛋白质稳定性较差。相变点能够反映蛋白质结构变化，从而推测物质变化的规律[15]。由图1可以看出，上海青对应的相变温度依次为51.38、60.55、63.75、70.96、84.61、104.66、109.85℃，均高于菠菜42.59、50.80、56.36、69.39、76.44、82.49、86.90℃，表明上海青的类囊体膜热稳定性优于菠菜。而在30～90℃的温度区间内，菠菜的热容变化明显高于上海青，热容变化越大表明蛋白质的稳定性越差，容易在加工中受热处理的影响而发生改变，能够反映出上海青的类囊体膜的稳定性优于菠菜。

图1 类囊体膜的热容变化注：a菠菜类囊体膜体系；b上海青类囊体膜体系

2.2 热处理过程中多肽组分变化

由图2a、b可知，菠菜和上海青类囊体膜多肽组成及各组分比例存在较大差异，菠菜的类囊体膜多肽组分种类较上海青丰富。升温至60 ℃时菠菜和上海青类囊体膜多肽组分没有发生明显的变化；70℃时光系统Ⅱ外周天线蛋白LHCⅡ蛋白逐渐降解；90 ℃时，代表光系统Ⅰ反应中心蛋白质亚基PsaA和PsaB的条带模糊，说明此时光系统Ⅰ已经被破坏，结果与Hu等[16]相同。结果表明，温度对类囊体膜中的多肽组分有显著影响，70℃时光系统Ⅱ被破坏分解、90℃时光系统Ⅰ被破坏分解。多肽组分及功能的保持对于维持色素蛋白复合物中叶绿素的稳定性抑制其降解具有积极的影响，因此高温处理对叶绿素蛋白复合体的破坏不利于叶绿素的保持。

2.3 热处理过程中叶绿素含量的变化

如图3所示，菠菜类囊体膜中叶绿素a含量随着温度升高明显下降，叶绿素b也随之降低，与叶绿素a相比，叶绿素b的降解很小。而上海类囊体膜中叶绿素a含量变化呈现出波动的趋势，在60～70 ℃时降解最显著，但是叶绿素b的含量整体上变化不大。这与之前的研究结果叶绿素a 较叶绿素b对热处理有较低的耐受性[17]相同。

图3b中上海青在80℃时叶绿素含量上升，而图3a并没有观察到叶绿素a含量升高。可能是由于菠菜、上海青光系统Ⅱ捕光复合物组成和稳定性差异造成的。一方面，光系统Ⅱ捕光复合物在70℃左右时结构被破坏，释放出大量游离叶绿素，导致叶绿素含量增加[18]；但随着温度的增加，叶绿素因受热逐渐降解，表现为叶绿素含量下降。光系统Ⅱ捕光复合物的热稳定性不同，游离叶绿素释放过程存在差异，导致溶液中叶绿素含量变化趋势不同。不同种类的绿色蔬菜可能由于类囊体膜结构不同、组分不同、或组分之间比例不同而在同等的外界条件处理之下展现出了不同的特性[19]。

图2 热处理对类囊体膜多肽组分的影响注：a菠菜类囊体膜体系；b上海青类囊体膜体系

图3 热处理对类囊体膜溶液中叶绿素含量的影响注：a菠菜类囊体膜；b上海青类囊体膜

图4 热处理对类囊体膜溶液pH影响

2.4 热处理过程中pH的变化

图4可以看出随着温度的升高，菠菜和上海青的类囊体膜溶液的pH下降，在同样的热处理条件下上海青类囊体膜溶液的pH 值下降的幅度较菠菜小。类囊体膜pH变化的机理是光合作用下，通过电子传递链的作用，质子醌会接受氢离子，同时也会影响氢离子向类囊体通道转运，以此来使类囊体膜的基质侧的pH值发生明显的变化[20]。pH的下降说明热处理会抑制质子醌的释放和传递，加速氢离子的转运。不仅如此，pH的维持能够一定程度的保护类囊体膜中的热耗散功能从而保护光合器官免受破坏[21]。如果植物的pH梯度不够，不能保持一定的pH值，就不能耗散多余的热量，影响光合器官即增加叶绿素的解离和降解[22-23]。

因此，上海青能够维持较高的pH，在一定程度上保护了光合器官，减缓了叶绿素的解离与降解。然而菠菜体系由于pH的下降幅度更大，因此保护光和器官的效果相对较弱。

2.5 温度对类囊体膜蛋白荧光的影响

蛋白质变性过程中，芳香族氨基酸分子的侧链基团逐渐暴露于水溶液中，其所处的环境极性逐渐增加，因此蛋白质荧光发射峰的Amax最大吸收峰逐值渐增大，同时λmax最大吸收峰位置蓝移的程度能够反映出蛋白质构象变化的程度。蓝移的程度越大则能够说明，蛋白质构象变化的程度也越大。由附表可以看出，菠菜最大吸收峰位波动幅度较上海青大，但最大峰值均出现先上升再下降的趋势，说明加热处理改变了类囊体膜上的蛋白质的组成和结构[24]。菠菜在80 ℃、上海青在90 ℃时蛋白质的荧光强度下降，这说明热处理对蛋白质的破坏程度逐渐增强，使得类囊体膜的多肽组分发生了降解，导致了蛋白质组分和含量减少，从而导致蛋白质荧光强度的减弱。色氨酸的热分解是分三步，首先脱去氨基和羧基，其次脱去乙基，最终是剩余物的完全热氧降解。因此我们也可以认为在80℃以上时进行的是第三步的完全降解，最终导致荧光强度的下降[25]。

附表 热处理对类囊体膜溶液体系蛋白发射荧光光谱的影响(278nm)

注：λmax最大吸收峰位；Amax最大吸收峰值

3 结论

差式扫描微量热仪的数据显示上海青的类囊体膜热稳定性较菠菜的更强，即不同种类蔬菜的类囊体膜在物理性质上存在差异，同时上海青和菠菜类囊体膜的多肽组分差异很大，这些多肽对温度敏感，温度越高多肽降解越显著。加热过程中上海青和菠菜的类囊体膜溶液的pH会逐渐下降，叶绿素蛋白复合体结构被破坏，使一部分蛋白质的氨基酸残基暴露出来，继续加热，会导致这种破坏的程度更大，从而使得蛋白质的分解，与之对应，叶绿素含量随温度的上升而下降。综上所述，在加工过程中可以通过保持类囊体膜上的叶绿素蛋白复合体的稳定性来调控加工绿色蔬菜颜色的劣变。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Effects of Thermal Treatment on Stability of Thylakoid Membrane and Chlorophyll of Spinach andBrassicachinensis

FAN Chang-chang，XIONG Xin-xing，ZOU Ya-hong，YU Hao-yong，ZHANG Yan

(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University/National Engineering & Technology Center for Fruit and Vegetable Processing，Beijing 100083，China)

The deterioration of color in green vegetables is closely related to the stability of chlorophyll-protein complexes located in thylakoid membrane during processing and storage.We tested heat capacity，polypeptides，chlorophyll content，pH and protein emission spectra of thylakoid membrane solution in spinach andBrassicachinensisunder thermal treatment，it showed that thermal treatment would lead to the degradation of chlorophyll-protein complexes and decrease of pH in thylakoid membrane solution.Otherwise，thylakoid membrane ofBrassicachinensisis more thermal stable and the remaining ratio of chlorophyll content is higher than spinach.All these provide a theoretical basis to clarify the mechanism of green vegetable color deterioration and to find a better way to protect green.

thylakiod membrane; chlorophyll-protein complexes; thermal stability; chlorophyll

高静压加工绿色蔬菜颜色品质变化的分子机制研究(项目编号：31271910)；加工绿色蔬菜中叶绿素蛋白复合体和叶绿素的降解与控制策略(项目编号：31571844)。

樊昶昶(1994— )，女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

张燕(1977— )，女，博士，副教授，研究方向：果蔬加工技术理论与应用。