微生物固定化载体筛选及其水质处理效果研究

朱 曦，衣萌萌，王 淼，卢迈新

(1. 大连海洋大学水产与生命学院，大连 116023；2. 中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 510380)

微生物固定化载体筛选及其水质处理效果研究

朱 曦1,2，衣萌萌2，王 淼2，卢迈新2

(1. 大连海洋大学水产与生命学院，大连 116023；2. 中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 510380)

固定化载体；蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)；负载性能；水质

2015年中国水产品总产量6 699.65万吨，比上年增长3.69%，渔业产值11 328.70亿元，其中水产养殖产值8 274.78亿元，占渔业产值73.05%，可见水产养殖在全国渔业中占据重要地位[1-2]。但随着水产养殖业的迅速发展，养殖过程中过量输入的氮、磷等引起的水质污染问题日益严重[3-4]。

目前，对养殖水体的处理方法主要有物理法、化学法及生物法，其中生物法中的微生物法具有成本低，污染小，操控简单，修复时间短等优势[5]，被研究者广泛应用[6-8]。但悬浮微生物法存在启动慢、菌体易流失、对激烈的水力条件变化敏感等缺陷[9]，而固定化微生物法与之相比，具有反应启动快、操作稳定、效率高、反应易控、对环境耐受强等优点[10-12]，因此在养殖废水处理中具有广阔的应用前景[13-15]。筛选得到吸附能力强、稳定、廉价、无污染的微生物载体成为微生物修复研究方面的热点之一[16]。

1 实验材料与方法

1.1 蜡样芽孢杆菌来源

实验所用蜡样芽胞杆菌(NY5株)可有效降低水体氨氮、亚硝酸盐氮浓度，并对硝酸盐氮也有一定的处理效果[18]。

1.2 不同载体对NY5的吸附

分别称量10 g沸石、火山石、陶环、牡蛎壳、核桃壳，放入250 mL三角瓶中，灭菌后烘干备用。挑取NY5单菌落至LB液体培养基，170 r/min，30 ℃培养12 h后计数，分别将200 mL菌液倒入三角瓶中浸泡载体并静置，对照组添加等体积的LB液体培养基，每组设3个平行。分别在2、4、6、8、12、24 h对实验组和对照组进行计数，通过同一时间点实验组和对照组菌数之差确定载体在该时间对NY5的载菌量，并绘制相应的吸附曲线，将载菌量最高的时间作为最佳吸附时间。载菌量计算公式为：

Yn=(C0-Cn)×V/G

其中，Yn为nh的载菌量(CFU/g)，C0为菌液初始浓度(CFU/mL)，Cn为nh的菌液浓度(CFU/mL)，V为菌液体积(mL)，G为载体质量(g)。

1.3 固定化NY5处理养殖废水

分别取60 g五种载体并用白色纱布包裹后装入烧杯，灭菌后烘干备用。挑取NY5单菌落至LB液体培养基，170 r/min，30 ℃培养12 h后计数。分别将500 mL菌液倒入装有载体的烧杯浸泡，并计算载体对NY5的吸附量(浸泡时间依据1.2 中的最佳吸附时间)。

表1 罗非鱼养殖池塘废水初始水质指标Tab.1 The initial water quality indicators of wastewater of Tilapia aquaculture ponds mg/L

1.4 水质指标检测方法

1.5 数据分析

采用SPSS 17.0软件对同一取样时间点的各组数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，最终数据以平均值±标准差的形式表示，通过Duncan对比同一时间点不同处理的差异，字母不同表示各组间存在显著性差异，以P<0.05作为差异显著性检验水平。数据经SPSS 17.0软件的描述统计进行标准化处理后，通过因子分析进行主成分分析，并通过综合评价函数(F)评价水质处理效果[20-21]。

2 结果与分析

2.1 不同载体对NY5的吸附性能曲线

不同载体对NY5的吸附性能见图1。随着实验的进行，各组载体载菌量总体呈先上升再下降最终趋于平缓的趋势。沸石、火山石、陶环及牡蛎壳4种载体均在6 h时对NY5的吸附量达到最大，载菌量分别为1.25×109、6.88×108、8.57×108、 8.97×108CFU/g。核桃壳在4 h时出现最大载菌量，为8.37×108CFU/g，而6 h时也维持了较高的载菌水平，因此将6 h视为所有载体的最佳吸附时间。

图1 各载体载菌量随时间的变化Fig.1 The bacteria adsorption capacity of different carriers over time

2.2 固定化NY5对养殖废水各指标处理效果

图2 不同处理组水体 -N浓度随时间变化Fig.2 The -N concentration of different treatment groups over time 字母不同表示同一时间不同处理间存在 显著差异(P<0.05)，下同。

图3 不同处理组水体 -N浓度随时间变化Fig.3 The -N concentration of different treatment groups over time

2.2.3 固定化NY5对养殖废水TN的处理效果

各实验组TN浓度随时间变化如图4所示。第7天时火山石NY5组、陶环NY5组、牡蛎壳NY5组、核桃壳NY5组TN浓度均显著低于空白对照和游离NY5组，其中牡蛎壳NY5组TN浓度与空白对照相比降低36.77%。第14天时游离NY5组、核桃壳NY5组和火山石NY5组TN浓度与空白对照相比分别降低36.58%、47.64%、51.64%。第21天时沸石NY5组、陶环NY5组、牡蛎壳NY5组、核桃壳NY5组TN浓度均低于空白对照，但差异不显著，第28天和35天，除游离NY5组外，其他实验组TN浓度均低于空白对照，但差异不显著。

图4 不同处理组水体TN浓度随时间变化Fig.4 The TN concentration of different treatment groups over time

图5 不同处理组水体 -N浓度随时间变化Fig.5 The -N concentration of different treatment groups over time

2.2.5 固定化NY5对养殖废水COD的处理效果

各实验组COD浓度随时间变化如图6所示。第7天时各固定化NY5实验组COD浓度均低于空白对照和游离NY5组，其中沸石NY5组、火山石NY5组及核桃壳NY5组COD浓度与空白对照相比分别降低42.52%、46.46%、36.22%。第14天时火山石NY5组COD浓度显著低于空白对照和游离NY5组。第21天时火山石NY5组、陶环NY5组、牡蛎壳NY5组COD浓度均低于空白对照，但差异不显著。第28天时沸石NY5组、牡蛎壳NY5组COD浓度均低于空白对照，但差异不显著。第35天时火山石NY5组COD浓度显著低于空白对照和游离NY5组，而沸石NY5组及牡蛎壳NY5组COD浓度虽均低于空白对照，但差异不显著。

图6 不同处理组水体COD浓度随时间变化Fig.6 The COD concentration of different treatment groups over time

2.3 固定化NY5对养殖废水处理效果的综合评价

本实验测定的水质指标较多，但是单独的某个指标无法代表水质的整体处理效果。主成分分析法及综合评价函数通过降维处理对多维变量进行综合和简化，可以较为准确地了解各实验组的综合表现，吉祝美等[22]在研究中详述了综合评价函数在水质综合评价中的应用，因此为分析各实验组对养殖废水的综合处理效果优劣，本实验采用主成分分析法提取各时间段各实验组水质指标的主成分，并通过综合评价函数(F)对养殖废水处理效果进行综合评价。

表2 各实验组对养殖废水的综合处理效果Tab.2 Comprehensive treatment effect of each group on the aquaculture wastewater

续表2

注：F1、F2、F3分别为第一主成分、第二主成分、第三主成分。

实验各载体NY5组水质综合评价结果见表1，排名最后5位的依次是第28天时的牡蛎壳NY5组、第21天时的火山石NY5组、35 d时的牡蛎壳NY5组、第14天时的牡蛎壳NY5组和第35 d时的火山石NY5组，说明这几个实验组在相应时间点水质综合处理效果较好，水质得到改善，其中第35天时的火山石NY5组得分排名最后，说明第35天火山石NY5组水质综合处理效果最好。排名前5位的依次是第7 天时的游离NY5组、第28天时的核桃壳NY5组、第7天时的空白对照、第7 天时的陶环NY5组和第7 d时的沸石NY5组，说明这几个实验组相应时间点水质较差，其中第7天时的游离NY5组排名最前，说明第7 天游离NY5组水质综合处理效果最差。

3 讨论

3.1 各载体载菌能力

载体载菌的数量主要受其种类、比表面积和内部结构的限制[23]。本实验结果显示，所选取的各载体载菌能力依次为沸石>牡蛎壳>核桃壳>陶环>火山石。有研究表明，沸石具有多维孔道体系以及独特的化学性质，因此具有很好的表面吸附性能[24]。而牡蛎壳具有棱柱层、叶片状结构，因此具备良好的吸附和包接能力。这两种材料的特性均为NY5提供了更多的附着位点，因此具有相对较高的载菌能力。尽管各种载体的最大载菌量有差距，但是本实验所选取的沸石、牡蛎壳、核桃壳、陶环和火山石这五种载体对NY5的单位最大负载量均大于108CFU/g，表明这五种载体对NY5的负载性能都比较好，均可用于固定化NY5处理养殖废水的进一步研究。

3.2 不同固定化NY5组对养殖废水处理效果

3.3 不同固定化NY5组对养殖废水的综合处理效果评价

由于各固定化NY5组在不同的水质指标处理方面的优劣各异，为综合评价各载体固定化NY5对养殖废水的处理效果，本实验通过主成分分析、引入综合评价函数(F)量化描述各实验处理对养殖废水的综合处理效果。鲁斐等[33]在研究中通过这种方法对辽河的水质状况进行评价，郭翔云等[34]通过这种方法对白洋淀水质状况进行评价。而在本实验中，通过综合评价可以看出，各固定化NY5组对养殖废水的综合处理效果较好，其中火山石NY5组和牡蛎壳NY5组对养殖废水的水质改善效果尤为突出，相较于游离NY5也有明显的优势，该结果与贾燕等[35]用固定化硝化细菌去除氨氮结果类似。可见火山石、牡蛎壳是在微生物固定化修复中具有良好潜力的载体，同时这两种材料又具有廉价、稳定、无污染的优点。因此建议在使用益生菌处理养殖废水时结合火山石、牡蛎壳以得到更长期、稳定的效果。

[1] 农业部渔业渔政管理局.2016中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社, 2016.

[2] 袁 媛, 袁永明, 贺艳辉, 等.罗非鱼不同池塘养殖模式生产成本及经济效益分析[J].江苏农业科学, 2013, 41(8): 217-219.

[3] Tovar A, Moreno C, Mánuel-Vez M P, et al.Environmental implications of intensive marine aquaculture in earthen Ponds[J].Mar Pollut Bull, 2000, 40(11): 981-988.

[4] 彭志英, 王亚南.养殖生态环境与生态水产品的发展[J].广东海洋大学学报, 2004, 24(4): 72-76.

[5] 郑焕春, 周 青.微生物在富营养化水体生物修复中的作用[J].中国生态农业学报, 2009, 17(1): 197-202.

[6] 李雪梅, 杨中艺, 简曙光.有效微生物群控制富营养化湖泊蓝藻的效应[J].中山大学学报(自然科学版), 2000, 39(1): 81-85.

[7] 明 晶.芽孢杆菌在改良水体环境中的作用[J].科学养鱼, 2006, (4): 76-76.

[8] 陈尚智, 胡勇有.枯草芽孢杆菌对微污染水体的净化作用[J].环境科学学报, 2011, 31(8): 1594-1601.

[9] 谢东海, 韩 奇, 唐文浩.微生物固定化技术在污水处理中的应用[J].环境与可持续发展, 2006, (4): 48-50.

[10] 郭雪琳, 王成端.固定化微生物技术在废水处理中的应用[J].广东化工, 2007, 34(8): 67-69.

[11] Yuan L J.Immobilization and degradation performance of efficient phenol-degrading bacteriaBacillussp.JY01[J].Environ Sci Technol, 2010, 33(4): 49-52.

[12] Zhang X X, Geng C X, Fang M M, et al.Bioremediation of petroleum contaminated soil by immobilized microorganisms[J].Acta Petrol Sin, 2008, 24(4): 409-414.

[13] Yang F C, Yu J T.Development of a bioreactor system using an immobilized white rot fungus for decolorization[J].Bioproc Biosyst Eng, 1996, 15(6): 307-310.

[14] Marwaha S S, Grover R, Prakash C, et al.Continuous biobleaching of black liquor from the pulp and paper industry using an immobilized cell system[J].J Chem Technol Biot, 2010, 73(3): 292-296.

[15] Zhang F M, Knapp J S, Tapley K N.Development of bioreactor systems for decolorization of Orange II using white rot fungus[J].Enzyme Microb Tech, 1999, 24(1-2): 48-53.

[16] 李廷梅.复合固定化微生物对河水中氨氮去除效果研究[D].郑州大学, 2014.

[17] 刘观斌, 王 淼, 卢迈新, 等.一株能抑制罗非鱼源无乳链球菌的反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定[J].中国水产科学, 2016, 23(1): 207-217.

[18] 刘观斌.芽孢杆菌在罗非鱼无乳链球菌病综合防控中的应用研究[D].上海：上海海洋大学, 2015.

[19] 国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法[M].(第四版).北京：中国环境科学出版社, 2002.

[20] 王晓鹏.河流水质综合评价之主成分分析方法[J].数理统计与管理, 2001, 20(4): 49-52.

[21] 王 维, 苏文利, 高 兴.水体富营养化评价方法及其应用[J].海河水利, 2012, (3): 6-10.

[22] 吉祝美, 方 里, 张 俊, 等.主成分分析法在SPSS软件中的操作及在河流水质评价中的应用[J].环保科技, 2012, 18(4): 38-43.

[23] 刘金苓, 钟玉鸣, 王丽娇, 等.厌氧氨氧化微生物的吸附、包埋固定化效果初探[J].环境科学学报, 2010, 30(3): 470-476.

[24] 成 岳, 王连军, 李健生.环境协调型材料—沸石的特性与应用进展[J].中国非金属矿工业导刊, 2004, (5): 37-40.

[25] 张晟瑀, 林学钰, 周兰影, 等.沸石联合微生物固定化去除微污染水体中氨氮的研究[J].环境污染与防治, 2009, 31(4): 14-17.

[26] 尹艳娥, 李秋瑜, 胡中华.炭纤维生物小球的优化及其对苯酚去除的研究[J].工业水处理, 2006, 26(7): 17-18.

[27] Date Y, Isaka K, Sumino T, et al.Microbial community of anammox bacteria immobilized in polyethylene glycol gel carrier[J].Water Sci Technol, 2008, 58(5): 1121.

[28] Jeong S K, Cho J S, Kong I S, et al.Purification of aquarium water by PVA gel-immobilized photosynthetic bacteria during goldfish rearing[J].Biotechnol Bioproc E, 2009, 14(2): 238-247.

[29] 李龙飞, 秦小明, 周翠平, 等.牡蛎壳的综合利用[J].北京农业, 2014, (27)：134-136.

[31] 张利波, 彭金辉, 范兴祥, 等.核桃壳综合利用技术的现状[J].生物质化学工程, 2003, 37(2): 21-25.

[32] Scholz M, Martin R J.Ecological equilibrium on biological activated carbon[J].Water Res, 1997, 31(12): 2959-2968.

[33] 鲁 斐, 李 磊.主成分分析法在辽河水质评价中的应用[J].水利科技与经济, 2006, 12(10): 660-662.

[34] 郭翔云, 崔慧敏.主成分分析法在白洋淀水质评价中的应用[J].海河水利, 2005, (5): 55-56.

[35] 贾 燕, 江 栋, 刘 永, 等.固定化硝化细菌去除氨氮和气相氨的试验研究[J].给水排水, 2009, 35(s1): 243-247.

(责任编辑：邓 薇)

Studies on screening of immobilized-microbe carriers and their effects for aquaculture wastewater treatment

ZHU Xi1,2, YI Meng-meng2, WANG Miao2, LU Mai-xin2

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China2.PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheriesScience;KeyLaboratoryofTropical&SubtropicalFisheryResourceApplication&Cultivation,MinistryofAgriculture,Guangzhou510380,China)

immobilized carrier;Bacilluscereus; carrying capacity; water quality

2017-01-06；

2017-03-17

现代农业产业技术体系专项资金 (CARS-49);广东省海洋渔业科技与产业发展专项科技攻关与研发项目(A201401B04)

朱 曦(1990- )，男，硕士研究生，专业方向为水产健康养殖技术。E-mail：zhuxi040471@163.com

卢迈新。 E-mail: mx-lu@163.com

S959

A

1000-6907-(2017)03-0058-08