α-烯醇化酶在恶性胸腔积液诊断中的应用研究

李汝芳，刘 凌，王旭明，武江海，冯家钢，赵芝焕

·论著·

α-烯醇化酶在恶性胸腔积液诊断中的应用研究

李汝芳，刘 凌，王旭明，武江海，冯家钢，赵芝焕*

目的 探讨α-烯醇化酶在恶性胸腔积液中的临床诊断价值。方法 选择2014年9月—2015年9月昆明医科大学第一附属医院呼吸内科及胸外科住院的胸腔积液患者。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测α-烯醇化酶水平。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价α-烯醇化酶诊断恶性胸腔积液的价值。结果 150例胸腔积液患者中恶性胸腔积液患者50例，其中，肺腺癌29例，小细胞肺癌1例，未分型20例；结核性渗出性胸腔积液患者50例；类肺炎性胸腔积液患者50例。3类胸腔积液患者α-烯醇化酶水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中恶性胸腔积液患者α-烯醇化酶水平较结核性渗出性胸腔积液和类肺炎性胸腔积液患者升高(P<0.05)；结核性渗出性胸腔积液与类肺炎性胸腔积液患者α-烯醇化酶水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。α-烯醇化酶诊断恶性胸腔积液的ROC曲线下面积(AUC)为0.866。约登指数最大(0.74)时截断值为4.22 μg/L，诊断恶性胸腔积液的灵敏度和特异度分别为88%和86%。结论 α-烯醇化酶水平在恶性胸腔积液中较结核性渗出性胸腔积液及类肺炎性胸腔积液显著升高，在恶性胸腔积液诊断中具有较高的灵敏度和特异度，可作为诊断恶性胸腔积液新的肿瘤标志物。

胸腔积液,恶性；磷酸丙酮酸水合酶；灵敏度；特异度

李汝芳，刘凌，王旭明，等.α-烯醇化酶在恶性胸腔积液诊断中的应用研究[J].中国全科医学，2017，20(14)：1689-1692.[www.chinagp.net]

LI R F,LIU L,WANG X M,et al.Value of alpha-enolase in the diagnosis of malignant pleural effusion[J].Chinese General Practice，2017，20(14)：1689-1692.

α-烯醇化酶是糖酵解途径中的关键酶，目前研究发现其在头颈癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、甲状腺嗜酸细胞瘤等多系统肿瘤中表达上调[1-5]，在肺癌患者癌组织及血清中显著升高[6-7]。本课题组前期研究显示，肺腺癌组肋间肌中α-烯醇化酶表达水平较纵隔良性肿瘤组升高[8]。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法定量测定胸腔积液中α-烯醇化酶水平，以研究其对恶性胸腔积液的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2014年9月—2015年9月昆明医科大学第一附属医院呼吸内科及胸外科住院的胸腔积液患者。排除标准：(1)同时合并支气管扩张、肺动脉栓塞、支气管哮喘等；(2)其他系统恶性肿瘤转移至胸膜引起胸腔积液；(3)合并结缔组织病；(4)接受过放疗和化疗及抗结核治疗。

1.2 诊断 (1)恶性胸腔积液：恶性胸腔积液患者均经内科胸腔镜下胸膜活检、胸部CT、脱落细胞学或电子支气管镜检查及开胸肺活检获得病理组织学或细胞学依据而确诊，留取标本前，患者均未进行放疗以及全身或胸腔局部的化疗。(2)结核性渗出性胸腔积液：诊断依据为：①有发热、盗汗、咳嗽、咳痰、气促、胸痛等症状；②痰液涂片查找到结核分支杆菌；③诊断性抗结核治疗后，病情好转并排除由其他原因引起的渗出性胸腔积液；④经肺部X线片或CT检查见结核病灶；⑤内科胸腔镜等检查时可见结核结节，病理结果提示干酪样坏死。以上5项中符合3项或单项②、③、⑤均可确诊。留取标本前，患者均未进行抗结核治疗。(3)类肺炎性胸腔积液：符合2013年中华医学会呼吸病学分会制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》中的肺炎诊断标准[9]，排除其他原因引起的胸腔积液。

1.3 试剂与方法 患者第一次行胸腔穿刺引流胸腔积液时，留取胸腔积液5 ml，经3 000 r/min离心15 min(离心半径5.5 cm)，将上清液置于EP管中，放于-80 ℃冰箱统一冷冻待检。测试前将样品从冰箱中取出，在室温下放置4 h，充分摇匀样品，采用ELISA法检测α-烯醇化酶水平，试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 一般资料 150例胸腔积液患者中恶性胸腔积液患者50例，其中，肺腺癌者29例，小细胞肺癌者1例，未分型者20例；结核性渗出性胸腔积液患者50例；类肺炎性胸腔积液患者50例。3类胸腔积液患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 3类胸腔积液患者性别、年龄比较

Table1Comparisonofgenderandagedistributionin3kindsofpatientswithpleuraleffusions

胸腔积液例数性别(男/女)年龄(岁)恶性胸腔积液5025/2560.0±14.5结核性渗出性胸腔积液5035/1557.1±11.0类肺炎性胸腔积液5035/1559.9±19.6χ2(F)值5.7422.503aP值0.0570.085

注：a为F值

2.2 α-烯醇化酶水平 3类胸腔积液患者α-烯醇化酶水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中恶性胸腔积液患者α-烯醇化酶水平较结核性渗出性胸腔积液和类肺炎性胸腔积液患者升高，差异有统计学意义(P<0.05)；结核性渗出性胸腔积液与类肺炎性胸腔积液患者α-烯醇化酶水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

Table2Comparisonofalpha-enolasein3kindsofpatientswithpleuraleffusions

胸腔积液例数α-烯醇化酶恶性胸腔积液505.51±1.99结核性渗出性胸腔积液503.49±1.30a类肺炎性胸腔积液503.77±1.29aF值13.994P值<0.001

注：与恶性胸腔积液患者比较，aP<0.05

2.3 α-烯醇化酶对恶性胸腔积液的诊断价值 α-烯醇化酶诊断恶性胸腔积液AUC为 0.866。根据约登指数最大法(0.74)选取 4.22 μg/L作为最佳截断值时，诊断恶性胸腔积液的灵敏度和特异度分别为88%和86%(见图1)。

图1 α-烯醇化酶诊断恶性胸腔积液的ROC曲线

Figure 1 ROC curve of alpha-enolase for the diagnosis of malignant pleural effusion

3 讨论

α-烯醇化酶是糖酵解途径中的一种关键酶，可催化2-磷酸甘油酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸，存在于大多数组织中，以二聚体形式存在，不仅表达于细胞质，在细胞质中发挥糖酵解的作用，也表达于细胞膜表面。L1、L2、L3环、两个镁离子结合谷氨酸、天冬氨酸及水分子组成α-烯醇化酶活性位点[10]。根据瓦博格效应，即使在氧含量较充足的条件下，肿瘤细胞也主要是以糖酵解的方式获得能量。肿瘤细胞通过增强糖酵解途径，进行代谢程序重新编程，使其以更高的效率吸收葡萄糖，实现快速生长[11]。本研究通过检测胸腔积液中的α-烯醇化酶水平，发现恶性胸腔积液中的α-烯醇化酶水平显著高于结核性渗出性胸腔积液及类肺炎性胸腔积液，提示α-烯醇化酶在恶性胸腔积液中高表达。α-烯醇化酶作为糖酵解途径中的关键酶，可通过加强糖酵解促进恶性胸腔积液的发生、发展。在缺氧、炎性细胞因子产生、细菌脂多糖刺激等因素作用下，α-烯醇化酶表达可增加[12]。恶性胸腔积液患者胸腔积液量多、增长快，胸腔积液压迫致肺不张，缺氧进一步加重，缺氧环境使α-烯醇化酶表达增加，促进胸腔积液的生成。

α-烯醇化酶作为纤溶酶原受体，血浆纤溶酶原通过α-烯醇化酶赖氨酸残基C端的位点与α-烯醇化酶结合，激活纤溶酶原系统，降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[4-5,13]。TSAI等[1]研究发现,α-烯醇化酶高表达与头颈癌的严重程度有关，可促进肿瘤的形成及侵袭，抑制因α-烯醇化酶表达产生的CCL20趋化因子，可明显减弱细胞的转化和侵袭作用，提示α-烯醇化酶可能通过诱导CCL20趋化因子促进肿瘤细胞的形成及侵袭。α-烯醇化酶在非小细胞肺癌中高表达，其可通过激活FAK/PI3K/AKT及下游信号调节糖酵解、细胞周期及EMT相关基因，并通过降解细胞外基质，促进肿瘤细胞转移及侵袭[6,14]。张莹等[7]研究结果显示,肺癌组织和肺癌患者血浆中α-烯醇化酶水平显著升高。α-烯醇化酶在非小细胞肺癌患者肺癌组织及胸腔积液肿瘤细胞表面高度表达，且与非小细胞肺癌的临床分期、复发呈正相关[15]。前期研究中发现在肺腺癌组肋间肌中α-烯醇化酶mRNA及其蛋白表达水平较纵隔良性肿瘤组升高，提示肺腺癌患者可以上调肋间肌α-烯醇化酶，且可能通过一些分子途径直接或间接地影响α-烯醇化酶在该患者远处组织的表达[8]。

上述研究样本来源于动物或是以肺癌患者癌组织、非癌组织或是血浆为标本，或是检测胸腔积液中肿瘤细胞表面的α-烯醇化酶表达情况。本研究通过ELISA法检测α-烯醇化酶在胸腔积液中的水平，结果提示恶性胸腔积液患者α-烯醇化酶水平较结核性渗出性胸腔积液和类肺炎性胸腔积液患者升高，与上述研究结果相一致，因此，α-烯醇化酶可能通过加强糖酵解途径、激活纤溶酶原系统、基因调控以及诱导炎性因子等多种途径参与肺癌的发生、发展、侵袭、转移等，并促进恶性胸腔积液的形成及发展。

本研究通过ROC曲线对胸腔积液中α-烯醇化酶进行分析，结果显示AUC为 0.866，提示胸腔积液中α-烯醇化酶可作为诊断恶性胸腔积液的一项指标，选取4.22 μg/L作为最佳截断值时，诊断肺癌的灵敏度和特异度分别为88%和 86%，提示可以此作为临床诊断判定的参考值。α-烯醇化酶作为一种在细胞代谢、病理生理等各个方面均发挥重要作用的蛋白，在肺癌的发生、发展中起到促进的作用，对恶性胸腔积液有一定的临床诊断价值，可作为诊断恶性胸腔积液新的肿瘤标志物。

本研究通过检测胸腔积液中的α-烯醇化酶水平，分析其对恶性胸腔积液有一定的临床诊断价值，但本研究仍存在以下局限性：(1)由于受研究对象条件的限制，纳入的样本数量少，未设置正常对照组；(2)部分肺癌患者未分型，故不能比较α-烯醇化酶在各种类型肺癌并恶性胸腔积液中的差异性；(3)研究对象均为昆明医科大学第一附属医院患者，受到区域限制，不能排除地域对α-烯醇化酶水平的影响；(4)α-烯醇化酶在多系统肿瘤中表达上调，本研究未纳入肺癌以外的肿瘤患者，故未行多系统肿瘤与肺癌并恶性胸腔积液α-烯醇化酶水平的比较。笔者下一步将针对本研究的局限性着手于更为严谨的实验方案，增大样本量，设置正常对照组，使结果更有代表性。

作者贡献：赵芝焕进行文章的构思与设计；刘凌、赵芝焕进行研究的实施与可行性分析；李汝芳进行数据收集、整理，撰写论文；李汝芳、王旭明进行统计学处理；李汝芳、武江海进行结果的分析与解释；王旭明进行论文的修订；刘凌负责文章的质量控制及审校；冯家钢对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Value of Alpha-enolase in the Diagnosis of Malignant Pleural Effusion

LIRu-fang,LIULing,WANGXu-ming,WUJiang-hai,FENGJia-gang,ZHAOZhi-huan*

No.2DepartmentofRespiratoryMedicine，FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China*Correspondingauthor:ZHAOZhi-huan,Chiefphysician；E-mail：jczzh@sina.com

Objective To study the clinical value of alpha-enolase in the diagnosis of malignant pleural effusion.Methods Inpatients with pleural effusions were recruited from the Department of Respiratory Medicine and Department of Thoracic Surgery,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from September 2014 to September 2015.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the concentration of alpha-enolase in pleural effusions.Receiver operating characteristic(ROC) curve was adopted to evaluate the value of alpha-enolase in the diagnosis of malignant pleural effusion.Results Of the 150 patients with pleural effusions,there were 50 patients with malignant pleural effusions(29 cases of lung adenocarcinoma,1 case of small cell lung cancer,20 cases of undifferentiated type of lung cancer),50 with exudative pleural effusions due to tuberculosis,and 50 with parapneumonic effusions.The concentrations of alpha-enolase in pleural effusions differed significantly among these 3 kinds of patients(P<0.05),specifically,they were higher in patients with malignant pleural effusions than in those with exudative pleural effusions due to tuberculosis or with parapneumonic effusions(P<0.05),but no significant differences in concentrations of alpha-enolase were found between patients with exudative pleural effusions due to tuberculosis and those with parapneumonic effusions(P>0.05).For diagnosing malignant pleural effusion,the area under the curve(AUC) of ROC of alpha-enolase was 0.866,the optimum cut-off point was 4.22 μg/L based on the maximum value ofYouden′sindex(0.74),the sensitivity and specificity at the optimum cut-off point was 88%,86%,respectively.Conclusion The concentration of alpha-enolase in malignant pleural effusion is significantly higher than that in exudative pleural effusion due to tuberculosis and in parapneumonia pleural effusion.The high sensitivity and specificity of the alpha-enolase in the diagnosis of malignant pleural effusion indicates that it can act a new tumor marker for malignant pleural effusion.

Pleural effusion，malignant；Phosphopyruvate hydratase；Sensitivity；Specificity

云南省卫生科技计划内设机构项目(2014NS165)

R 561.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.14.008

2016-08-03；

2017-02-22)

650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院呼吸内二科

*通信作者：赵芝焕，主任医师；E-mail：jczzh@sina.com