无机磷溶解菌RW8的筛选、鉴定及对白三叶促生效果研究

蔡璐，王小利，陈莹，王子苑，李小冬*

(1.贵州省草业研究所, 贵州 贵阳 550006；2.贵州省生物技术研究所, 贵州 贵阳 550006)



无机磷溶解菌RW8的筛选、鉴定及对白三叶促生效果研究

蔡璐1,2，王小利1，陈莹1，王子苑1，李小冬1*

(1.贵州省草业研究所, 贵州 贵阳 550006；2.贵州省生物技术研究所, 贵州 贵阳 550006)

从白三叶根际分离筛选9株溶磷微生物，并对挑选菌株进行形态、细胞以及种属鉴定，并分析其对白三叶的促生效果。通过分析溶磷圈与溶磷菌落直径的大小与比值获得溶磷量与持续溶磷能力较强的RW8菌株。通过形态与扫描电镜观察发现RW8是具有鞭毛的短杆菌，其菌落形态表面光滑，不透明；将RW8 16S rDNA序列比对NCBI数据库发现其与阴沟肠杆菌属(Enterobactersp.)的同源性高达99.5%，Biolog鉴定其与阴沟肠杆菌(Enterobactercloacaess dissolvens)的相似性为0.610。RW8溶磷量达424.85 μg/mL，溶磷能力可能与RW8的产酸性能(12.30 μg/mL)密切相关。RW8对白三叶根系与幼苗的生物产量的分配有显著影响，接种RW8后能抑制白三叶根系伸长，根系鲜重与干重有下降趋势，但差异不显著；而幼苗的生物产量(干重与鲜重)均显著高于对照(P<0.05)，并且该现象与植物生长激素IAA无关，其具体的作用机制还有待于进一步研究。

溶磷菌；白三叶；阴沟肠杆菌；有机酸

磷元素与氮元素作为影响植物生长发育最重要的2种大量元素，广泛参与能量转化、细胞分裂、光合作用、氧化还原反应等重要生理生化过程[1]。在自然界中，只有0.1%的磷元素能被植物吸收[2]，并且外源施加磷肥有75%被土壤中游离的金属离子螯合形成难溶性无机盐[3]。西南喀斯特地区的土壤多为石灰质黄壤与红壤，土壤中高浓度的钙离子与铁离子等易与游离的磷酸根离子结合形成难溶的无机磷化合物，造成该区域富含难溶性无机磷，而造成植物可以直接利用的游离磷含量十分匮乏[4-5]。

溶磷微生物是一群能够溶解土壤中难溶性磷，增加植物可利用磷含量的细菌、真菌以及放线菌的总称[6]，它们通过溶解磷为植物提供营养元素，植物则稳定的向溶磷微生物提供碳水化合物[7]。以往研究通过分离培养等方法已经从多种不同的生长环境中分离纯化了许多新的溶磷菌株，这些溶磷微生物与其宿主分属多个不同的种属[8-10]。其中，一些微生物可能具有宿主特异性，如钩状木霉(Trichodermahamatum)不仅能特异性促进黑吉豆(Vignamungo)的生产性能，还能增加其叶绿素、碳水化合物以及粗蛋白含量[11]。

目前豆科作物根际已经成功分离鉴定了一批溶磷微生物，并应用于生产。Pankaj等[12]发现假单胞菌与根瘤菌协同作用能促进大豆(Glycinemax)植株磷、铁含量提高。用复合微生物接种剂处理豌豆(Pisumsatium)等能显著增加豌豆根长、根系干重及产量[13]；类似的研究结果在箭筈豌豆(Viciasativa)、苜蓿(Medicagosativa)等作物中都有报道[14-15]；白三叶(Trifoliumrepens)是在贵州分布较为广泛的豆科牧草[16]，能通过自身的根瘤菌的固氮作用增加草地氮元素的含量，但是对磷元素和钾元素的消耗较大[17]，然而专门针对白三叶开展溶磷菌相关研究还比较少。因此筛选并开发与白三叶共生溶磷菌对提高草地肥力、建设低碳高效人工草地有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源和样地自然概况

2010年10月于贵州省草业研究所独山基地以五点法采取栽培白三叶根际土壤样品(附健康根系)，低温带回实验室进行溶磷菌分离。采样地位于东经106°12′-108°18′、北纬25°04′-27°29′，平均海拔997 m，年均气温13.6～19.6 ℃，年均降雨量1100～1400 mm，属典型亚热带温暖湿润的季风气候。土壤类型为黄壤土，其主要营养成分如下，全氮：0.218 g/kg，水解氮：156.98 mg/kg，有效磷：15.02 mg/kg，速效钾：10.20 mg/kg，有机质：1.695 g/kg，pH值为5.97。

1.2 溶磷菌筛选

溶磷菌分离方法参考林启美等[18]。具体方法如下，利用磷酸钙为无机磷培养基[3 g/L Ca3(PO4)2，10 g/L葡萄糖，0.5 g/L (NH4)2SO4， 0.2 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.03 g/L MgSO4·7H2O，0.03 g/L MnSO4，1000 mL无菌水，0.003 g/L FeSO4·7H2O，10 g/L 琼脂，pH值6.8]进行初选，采用10倍稀释法，取10-5与10-6稀释倍数的菌液100 μL均匀涂布于培养基上，28 ℃恒温培养15 d，统计在第3 天形成肉眼可见的菌落并编号，用直尺测量并记录第5, 10及15 天的透明溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)。挑选溶磷效果较好的菌株利用肉汤(Luria-Bertani, LB)培养基对菌株活化与保存。

1.3 RW8菌株溶解磷酸钙的能力与有机酸含量测定

接种1 mL活化的溶磷菌株到50 mL灭菌的含磷酸钙液体培养基中[3 g/L Ca3(PO4)2，10 g/L葡萄糖，0.5 g/L (NH4)2SO4， 0.2 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.03 g/L MgSO4·7H2O，0.03 g/L MnSO4，1000 mL无菌水，0.003 g/L FeSO4·7H2O，pH值6.8]，对照接等量的无菌水，重复3次，28 ℃、150 r/min振荡培养7 d；10000 r/min室温离心10 min，采用钼锑抗比色法测定其溶磷量[19]。同时另取15 μL上清液，采用液相色谱技术分析有机酸含量[日本岛津，紫外检测器(210 nm)，C18分析柱，流动相为0.01 mol/L KH2PO4，流速为1 mL/min], 具体实验操作见文献[20]。

1.4 RW8分泌吲哚乙酸(IAA)能力测定

接种1 mL活化的溶磷菌株到50 mL灭菌的无色氨酸King 培养基[21]，空白对照接种等量的无菌水，28 ℃，125 r/min振荡培养10 d。定性分析：取1 mL菌株悬浮液滴于检测板上，阳性对照采用1 mL 50，30与10 μg/mL的植物生长激素标准品，加入等量S2比色液[22]，15 min内室温下观察其颜色变化[23]。定量测定：首先配制100,50,25,12.5与0 μg/mL 5个浓度的IAA标准品，取1 mL标准品加等量的S2比色液，混匀，在黑暗中静置0.5 h后测定530 nm吸光值，并制定标准曲线，将培养的菌悬液于10000 r/min下离心10 min，取1 mL上清液按照标准品测定方法测定530 nm吸光值，根据标准曲线计算菌液中IAA含量。定性与定量分析均设置5个生物学重复。

1.5 RW8菌株鉴定

1.5.1 形态鉴定 在LB培养基上划线分离单菌落，28 ℃培养5 d观察菌落形态。接种到50 mL肉汤培养基振荡培养48 h。采用扫描电镜(Zeiss EVO18)观察细胞形态。

1.5.2 16S rDNA序列分析 接种RW8到15 mL培养基中28 ℃，125 r/min振荡培养3 d，用细菌基因组提取试剂盒(上海生工SK8225)提取DNA，PCR扩增16S rDNA序列，引物组合为F27(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)与R1492(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)，反应程序为90 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环，72 ℃ 7 min，25 ℃ 1 min，回收并测序RW8的16S rDNA序列。将测序的结果应用NCBI-Blast软件在线比对分析。采用BIOLOG微生物全自动鉴定系统鉴定筛选菌株的种属[24]。

1.6 RW8对白三叶的促生效果分析

将活化的RW8溶磷菌接种到50 mL灭菌的LB培养基中(对照接种5 mL无菌水到50 mL灭菌的LB培养基)；28 ℃，125 r/min振荡培养4～5 d至OD600=0.5，收集备用。供试牧草为白三叶(海法)，由贵州省草业研究所提供。将白三叶种子用0.1%的升汞表面消毒5 min，再用75%的酒精消毒3～5 min，用无菌水清洗3～4次，然后将种子播种在Hoagland固体培养基[16][0.945 g/L Ca(NO3)2，0.506 g/L KNO3，0.08 g/L NH4NO3，0.31 g/L Ca3(PO4)2，0.31 g/L AlPO4，0.493 g/L MgSO4，2.5 mL铁盐溶液，2 mL微量元素液，pH 6.0，3.5 g/L 琼脂，蒸馏水1000 mL]上，25 ℃萌发至幼苗长到3～4 cm，挑选生长一致的幼苗转移到新鲜培养基中，接种5 mL溶磷菌，对照接种5 mL空白培养基到25 ℃，16 h光照、8 h黑暗条件下培养40 d后测定相应表型性状，处理组与对照组各10个重复。采用直尺量取茎节到植株顶端的高度作为株高，量取茎节到根尖的长度记为根长。根系与幼苗生物量测量，将收获的组织样品105 ℃杀青15 min后，65 ℃烘干至恒重后称重。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌RW8的筛选

将稀释的菌液均匀涂布在筛选培养基，在第3天选取能形成肉眼可见菌落，共获得9个菌株，分别命名为RW1～RW9。溶磷圈的大小可以作为溶磷量的指示指标，反映不同菌种对磷酸钙的溶解能力；菌落直径大小则反映溶磷菌本身的生长活力，菌斑与菌落直径的比值大小反映了不同菌株的相对溶磷能力。在本研究中，每隔5 d分别记录并观察测量溶磷圈和溶磷菌落的直径。

在接种后的第5天，溶磷圈的大小分布在0.39～1.03 cm，其中，最大的3个依次为RW6，RW8与RW5，溶磷菌落的大小分布在0.14～0.33 cm，最大的3个菌种依次为RW6，RW5与RW8，溶磷圈与菌落比值分布在1.64～3.75，其中最大的3个依次为RW9，RW4与RW8(表1)。在接种后的第10天，溶磷圈的大小分布在0.59～1.49 cm，其中，最大的3个依次为RW8，RW9与RW6，溶磷菌落的大小分布在0.24～0.55 cm，最大的3个菌种依次为RW7，RW8与RW3，溶磷圈与菌落比值分布在1.07～3.04，其中最大的3个依次为RW8，RW5与RW9(表1)。在接种后的第15天，溶磷圈的大小分布在0.78～1.82 cm，其中，最大的3个依次为RW8，RW9与RW2，溶磷菌落的大小分布在0.39～0.83 cm，最大的3个菌种依次为RW1，RW8与RW2，溶磷圈与菌落比值分布在1.29～2.43，其中最大的3个依次为RW8，RW9与RW6(表1)。综合溶磷量、溶磷菌活力以及相对溶磷能力，RW8的应用价值最大，因此，对其进行鉴定以及促生研究。

表1 白三叶根际溶磷菌在磷酸钙无机磷培养基上的菌斑与菌落生长值Table 1 Diameters of plaque and colony of white clover phosphate-solubilizing bacteria (PSB) grown on calcium phosphate medium

注：a， 分离于根系周围的土壤；b， 分离于根系内部；c， 分离于根系表面。

Note:a, Phosphate-solubilizing bacteria was isolated from the soil around the root;b, Phosphate-solubilizing bacteria was isolated from the root extraction;c, Phosphate-solubilizing bacteria was isolated from the root surface.

2.2 溶磷菌RW8鉴定分析

从筛选平皿中将溶磷菌RW8划线分离单菌落，其表面光滑不透明，边缘整齐(图1A，B)。挑取单菌落接种于肉汤培养基中培养48 h后取样进行扫描电镜观察，结果显示，RW8为短杆菌，表面光滑，存在周身鞭毛(图1C)。进一步通过扩增16S rDNA获得长度为1465 bp的DNA区段，将测序的结果应用NCBI-Blast软件与已测序的菌种进行比对分析。RW8与路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)和阿斯布里肠杆菌(Enterobacterasburiae)的同源性分别达99.2%，99.1%；与肠杆菌属(Enterobactersp.)的同源性达99.5%(图2)。采用Biolog全自动细菌鉴定仪分析鉴定RW8为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacaess dissolvens)，相似性(SIM值)为0.610。

图1 溶磷菌RW8形态学观察Fig.1 Phenotypic observations of phosphate-solubilizing bacteria RW8

图2 RW8序列进化树图Fig.2 A neighbour join tree of phosphate-solubilizing bacteria strain of RW8Query为RW8比对模板。The “Query” was the query sequence of RW8.

2.3 溶磷菌RW8溶磷能力与分泌有机酸能力分析

为了深入分析RW8的溶磷能力，对其溶磷量进行了定量测定。接种相同体积的RW8活菌与蒸馏水到以磷酸钙为底物的培养基中，振荡培养7 d。接种前，处理组与对照组培养基中都只有痕量的磷元素，并且它们差异不显著(P>0.05)，振荡培养7 d后，对照组可溶性磷含量与培养前相比没有变化，而接种RW8菌种的培养基中可溶性磷含量增高，并显著高于对照组(表2，P<0.05)，说明RW8具有较强的溶解难溶性无机磷能力。

溶磷菌的解磷机制之一是向环境中分泌有机酸，促进难溶性磷溶解。定量测定了RW8向环境中分泌有机酸的含量。在接种前培养基中处理组与对照组均无有机酸，并且两者差异不显著(表2，P>0.05)，培养7 d后，对照组中有机酸含量没有显著变化，而处理组有机酸含量增加到12.30 mmol/L，显著高于对照组(P<0.05)，分泌有机酸是RW8溶磷机理之一。

表2 RW8溶磷菌株在磷酸钙培养液中的溶磷量及总有机酸量Table 2 Available phosphorus and total organic acid concentration of the culture medium after inoculated with RW8 phosphate-solubilizing bacteria (PSB)

注：同列中不同的字母表示差异在P<0.05水平显著。下同。

Note: Different letters in the same column indicated a significant difference atP<0.05 level. The same below.

2.4 菌株RW8对白三叶的促生效果

RW8能通过分泌有机酸促进难溶性磷溶解，然而其是否能促进植物生长还不清楚。比较分析在难溶性无机磷培养条件下，RW8菌种对白三叶幼苗的生长与生物产量的影响。接种RW8菌株显著的抑制了白三叶的根系生长，处理组比对照组的根长减少44.5%(P<0.05)，而溶磷菌对株高的影响不大，处理组与对照组没有显著差异(P>0.05，图3)。对生物产量分析发现，接种RW8溶磷菌显著促进了幼苗生物产量，其中处理组幼苗部分鲜重比对照组增加55.5%(P<0.05)，干重增加75.9%(P<0.05)。与处理组的根长显著缩短不同，接种RW8的根系生物量与对照组相比呈下降趋势，但差异没有达到显著水平(P>0.05，图3)。

2.5 溶磷菌分泌3-吲哚乙酸能力

在前人的研究中报道，土壤微生物分泌植物激素是其对植物促生作用的重要机制之一，其中最重要的一种激素为生长激素，因此，重点分析了RW8分泌生长激素的能力。通过染色定性分析发现RW8菌株不具备IAA分泌能力，定量测定同样发现接种RW8处理组只有痕量的IAA能够被检测到，其与对照组之间没有显著区别(表3，P>0.05)，因此RW8对白三叶的促生作用不是由于分泌生长素IAA造成。

图3 RW8对白三叶生长和生物产量的影响Fig.3 Effect of phosphate-solubilizing bacteria (PSB) strain RW8 on root length, plant height and biomass production in white clover*表示差异在P<0.05水平显著。* stands for a significant difference at P<0.05 level.

3 讨论

在初筛过程中，共鉴定到9个菌株具有溶磷性，其溶磷能力存在显著的菌种特异性。在接种早期(5 d)，RW6的溶磷圈与菌落直径都优于RW8(表1)；而在接种中期(第10天)与后期(第15天)，RW8溶磷菌斑以及菌落大小都优于RW6(表1)，这种变化可能是由于RW6溶磷机理不同积累有毒物质导致后期生长的菌体进入了衰亡期。或者可能是由于RW6为易发生突变的菌种，在培养过程中部分细菌丧失了溶磷能力。因为王光华等[25]研究发现一些溶磷细菌在传代培养过程中会丧失解磷能力，而且一旦丧失就不能再恢复，这可能与细菌相对较高的遗传突变频率有关。其具体的形成机制还有待于后续研究。因此在筛选细菌型溶磷菌时不仅需要考虑溶磷量，还要考虑其持续解磷能力与遗传稳定性。

表3 溶磷菌株RW8分泌吲哚乙酸(IAA)能力分析Table 3 Indole-3-acetic acid segregation ability of phosphate-solubilizing bacteria (PSB) strain of RW8

具有溶磷能力的微生物种类繁多，已报道具有溶磷能力的微生物包括细菌、真菌和放线菌等。溶磷真菌溶磷能力强，但种类较少，主要局限于青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)等4个属种[11]。溶磷细菌数量多，种类丰富，分别在假单胞菌(Pseudomonas)，芽孢杆菌(Bacillus)和阴沟肠杆菌(Enterobacter)等12个属种[7,26-28]。本研究系统地从形态、细胞(图1C)以及分子(图2)等多个角度综合鉴定RW8菌株为阴沟肠杆菌。肠杆菌属的部分菌株具有较高的解磷能力[29]，阴沟肠杆菌对无机磷和有机磷都具有很好的溶解能力，并已成功被开发为生物菌肥[30]与有机农药降解菌[31]。李晓举等[30]发现施用阴沟肠杆菌能显著提高烤烟的产量与品质，本研究结果同样发现RW8对白三叶地上部分具有良好的促生作用(图3)。

溶磷微生物的解磷机制主要与溶磷菌分泌的溶磷酶活性[32]与酸性物质含量密切相关[33-34]，有机酸是酸性物质的重要一种[35]。目前对阴沟肠杆菌产酸性研究的报道较少，在水稻(Oryzasativa)中粪产碱固氮菌A-15能够利用有机酸作为碳源，当其与阴沟肠杆菌E-26共培养时固氮效率显著增加，可能是E-26与A-15的代谢产物存在相互促进作用[36]。本研究鉴定的阴沟肠杆菌RW8具有较强的有机酸分泌能力(表2)，较强的有机酸分泌能力可能是其溶磷和促进植物生长的主要机理之一。

不同的水肥条件可以改变植物植株与根系生物量的分配，前人研究发现当植物面临营养胁迫[37]以及干旱胁迫[38]时会抑制地上部分生长，促进根系生长，可能是由于植物在面临营养或水分胁迫时刺激根系补偿性生长以吸收更多养分。接种RW8显著抑制白三叶根系伸长，但对根重没有显著影响(图3)，这种现象可能是由于根粗增加造成。接种RW8的处理组处于富营养水平，使植物可以利用更多的能量促进幼苗生长，而对照组处于缺磷水平需要促进根系生长以从环境中吸收更多磷元素，研究发现RW8确实对白三叶幼苗生长具有显著促进作用(图3)。然而通过定性与定量分析都发现RW8不能分泌植物生长激素IAA(表3)，这种现象与在禾本科牧草扁穗雀麦(Bromuscatharticus)的研究结果不完全相同，因此，不同溶磷菌与植物相互作用模式可能存在宿主特异性与调控方式的多样性。

4 结论

从贵州喀斯特生态条件下的白三叶根际筛选获得溶磷能力较强的RW8菌株。通过形态、细胞以及分子生物学鉴定RW8属于阴沟肠杆菌溶磷细菌。RW8能够分泌有机酸，但不分泌生长激素IAA。接种RW8显著抑制了白三叶根系伸长，但对根重影响不显著；对植物生物产量的促进效果明显，生产应用潜力较大。

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Isolation and identification of an inorganic phosphorus-solubilizing bacterium RW8 and its growth-promoting effect on white clover (Trifoliumrepens)

CAI Lu1,2, WANG Xiao-Li1, CHEN Yin1, WANG Zi-Yuan1, LI Xiao-Dong1*

1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 2.GuizhouInstituteofBiotechnology,Guiyang550006,China

Nine strains of inorganic phosphorus-solubilizing bacteria were isolated from the rhizosphere of white clover (Trifoliumrepens), and each strain was identified to the genus and species level based on its phenotypic and cytological characteristics. The growth-promoting effect of each strain on white clover was also analyzed. Strain RW8, which showed the strongest phosphorus-solubilizing activity, was selected based on analyses of the size and ratio of its plaques and colonies. Scanning electron microscopy observations revealed that RW8 wasBacillusbrevis, a flagellated bacterium. Colonies of RW8 were opaque and had a smooth surface. In NCBI blast searches, the 16S rDNA sequence of RW8 showed 99.5% homology with that ofEnterobactersp. A Biolog analysis suggested that RW8 had high similarity (0.610) withEnterobactercloacae. In a phosphorous-dissolving assay, RW8 produced 424.85 μg/mL dissolved phosphorus, which was possibly related to its strong organic acid production (12.30 μg/mL). RW8 strongly affected the biomass distribution to roots in white clover seedlings. Root elongation and the fresh weight and dry weight of roots were lower in RW8-colonized plants than in control plants, although the differences were not statistically significant. However, the seedling biomass (dry weight and fresh weight) of RW8-colonized white clover was significantly greater than that of control plants (P<0.05), and this phenomenon was not a result of indole acetic acid production by the bacterium. Further research is required to determine the precise mechanism of its growth-promoting effect.

phosphorus-solubilizing bacteria; white clover;Enterobactercloacae; organic acids

10.11686/cyxb2016282

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-07-14；改回日期：2016-10-19

贵州省农科院专项基金(黔农科院院专项[2013]03)，贵州省科技支撑计划(黔科合支撑[2016]2504号)和农科院自主创新科研专项(黔农科院自主创新科研专项字[2014]010号)资助。

蔡璐(1987-)，女，贵州贵阳人，助理研究员，学士。 E-mail: cailu225@sina.cn*通信作者Corresponding author. E-mail: lixiaodongzl@163.com

蔡璐, 王小利, 陈莹, 王子苑, 李小冬. 无机磷溶解菌RW8的筛选、鉴定及对白三叶促生效果研究. 草业学报, 2017, 26(5): 181-188.

CAI Lu, WANG Xiao-Li, CHEN Yin, WANG Zi-Yuan, LI Xiao-Dong. Isolation and identification of an inorganic phosphorus-solubilizing bacterium RW8 and its growth-promoting effect on white clover (Trifoliumrepens). Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 181-188.