云南松松针中黄酮类化合物抗氧化活性研究

付文鹏，李永飞，杨秀云，杨 柳，杨永寿

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

云南松松针中黄酮类化合物抗氧化活性研究

付文鹏1，李永飞1，杨秀云1，杨 柳1，杨永寿2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：研究云南松松针中黄酮类化合物的抗氧化活性，为云南松松针的开发利用提供依据。方法：用乙醇将干燥、粉碎后的云南松松针进行提取、精制、冷冻干燥，得总黄酮提取物；用DPPH法研究云南松松针黄酮类化合物清除自由基的能力，用硫代巴比妥酸法研究云南松松针黄酮类化合物对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的抑制作用。结果：云南松松针黄酮类化合物对DPPH自由基有很好的清除作用，能抑制肝匀浆自发性脂质过氧化产物MDA的产生。结论：云南松松针中黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化作用。

云南松松针；黄酮类化合物；DPPH自由基；抗氧化

云南松（Pinus yunnanensis Franch.），又称飞松、青松、长毛松，为松科松属常绿乔木〔1〕。分布于云南、西藏、四川、贵州等省区。松针是松科植物的针状叶，主要含挥发油、黄酮类（如莽草酸）、木脂素、维生素、氨基酸和多糖等物质〔2-3〕。松针的药用历史悠久，《本草纲目》记载“松叶，名为松毛，性温苦，无毒，入肝、肾、肺、脾诸经，治各脏肿毒，风寒湿疹，久服令人不老，轻身益气，主治风湿疮；生毛发，安五脏，守中，不饥延年”〔4〕，民间用来制作松针茶、松针枕。研究表明松针黄酮对心血管系统疾病有很好的疗效，并有很好的抗炎作用〔5〕。近年来，科学工作者通过研究，分别从银杏叶、茶叶等植物中提取得到多种黄酮类化合物，并证明黄酮类化合物具有较好的抗脂质过氧化和清除体内自由基的能力，具有很好的医疗保健价值。目前对云南松松针的研究较少，研究工作者重点集中于对松塔的研究，并发现松塔中具有抗HIV活性和对静息及致痉离体气管平滑肌有松弛作用的成分〔6-7〕。本研究拟对云南松松针中黄酮类化合物进行提取、精制，并利用体外模型研究其抗脂质过氧化和清除自由基的能力，以此评价其抗氧化活性，为云南松及其松针的进一步开发利用提供依据。

1 试验材料与仪器

1.1材料云南松松针采自云南大理苍山，除杂后切成5~6 cm长，于60℃干燥16 h〔8〕，粉碎，贮于密封袋中备用。试验用大鼠为SD昆明大鼠，180~220 g，雄性，由昆明医科大学实验动物中心提供（批号：43004700017373）。

1.2试剂1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，东京化成工业株式会社，批号：217-591-8）；硫代巴比妥酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150123）；维生素C（上海化学试剂分装厂，批号：15-01-10）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3仪器T-6型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AL204-IC型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；DFY-200型摇摆高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）；D2KW-4型恒温水浴锅（上海科析试验仪器厂）；FDU-2100型冷冻干燥机（东京理化）；101A-2B电热鼓风干燥箱（上海崇明实验仪器厂）；LC-4012型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1松针中总黄酮的提取取100 g云南松松针粉，用70%乙醇〔8〕90℃下回流提取3次，时间分别为1.5、1.0、1.0 h。合并提取液，过滤，取滤液减压浓缩至无醇味，加适量水溶解，用石油醚萃取3次，取水层减压浓缩，硅胶柱层析洗脱纯化，减压浓缩，冷冻干燥、得松针总黄酮提取物7.16 g，总黄酮提取率为7.16%，密封冷藏保存，备用。

2.2溶液的配制

2.2.1 供试品溶液的配制 精密称取“2.1”项制备的松针总黄酮提取物适量，用70%乙醇配制成1 mg/mL的储备液，用70%乙醇稀释成不同浓度的测试液。

2.2.2 DPPH溶液的配制 精密称取DPPH 2.2 mg，用无水乙醇配制0.2 mmol/L的溶液，临用新配。

2.2.3 10%硫代巴比妥酸溶液的配制 精密称取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中，加少量1 mol/L NaOH溶液溶解，再用10%三氯乙酸定容至刻度，摇匀，即得，临用新配。

2.2.4 维生素C溶液的配制 精密称取维生素C 10.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，定容，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL的储备液，临用新配，用时用水稀释成不同浓度的测试液。

2.3清除DPPH能力测定参照文献方法略作修改〔9〕，实验在10 mL棕色容量瓶进行，分为空白管、对照管和样品管。空白管中精密加入1.0 mL样品溶液和2.0 mL无水乙醇，对照管中精密加入1.0 mL无水乙醇和2.0 mL DPPH溶液，样品管中精密加入1.0 mL样品溶液和2.0 mL DPPH溶液，密塞，混匀，暗处放置30 min，用水定容至刻度，用空白溶剂做参比，于517 nm下测定吸光度值，按下式计算自由基的清除率：

I（%）=［1－（A样品－A空白）/A对照］×100%

2.4抗脂质过氧化作用测定将健康大鼠禁食12 h，用乙醚麻醉，迅速取出肝脏，用4℃生理盐水洗净血液，吸干水分，切碎，用玻璃匀浆器在冰水浴中研磨制得质量分数10%大鼠肝匀浆（肝脏：4℃生理盐水=1：9），3 000 r/min低温离心10 min，取上清液在冰箱中冷藏备用〔10〕。参照文献方法略作修改〔10-11〕，实验分为空白管、对照管、药物底管及药物管。空白管中精密加入2.0 mL生理盐水和3.0 mL水，对照管中精密加入肝匀浆2.0 mL和1.0 mL水，药物底管精密加入1.0 mL样品溶液、2.0 mL生理盐水和2.0 mL水，药物管精密加入1.0 mL样品溶液、2.0 mL肝匀浆，摇匀，于37℃恒温水浴振荡1 h，对照管和药物管分别加入10%硫代巴比妥酸溶液2.0 mL，沸水浴加热15 min，冷却，3 000 r/min离心10 min，空白校正，取上清液于532 nm处测定吸光度值，平行3份，按下式计算抑制率：

I（%）=［A对照-（A药物管-A药物底管）］/A对照×100%

3 结果

3.1云南松松针黄酮类化合物对DPPH自由基的清除作用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心的自由基，呈紫色，在517 nm处有最大吸收，其浓度与吸光度呈线性关系。当DPPH自由基与抗氧化剂给出的H·结合，体系颜色变浅，在517 nm处的吸光度值会降低，通过计算抗氧化剂对DPPH的清除率以及清除50%自由基时的溶液质量浓度IC50，来评价抗氧化剂的抗氧化活性。见表1和图1。

表1 不同浓度云南松松针黄酮和维生素C溶液对DPPH自由基的清除作用

图1 维生素C和云南松松针黄酮对DPPH自由基清除曲线

由表1和图1可见，云南松松针黄酮和维生素C溶液对DPPH自由基都有较强清除能力，但云南松松针黄酮弱于维生素C。通过SPSS 11.0软件计算得出云南松松针黄酮和维生素C的IC50分别为0.177 mg/mL和0.033 mg/mL。随松针黄酮浓度的增大，其自由基清除率也增大，当松针黄酮溶液达到一定浓度时，清除率达到最大，并且随着松针黄酮浓度的增大，清除率不在增加。即云南松松针黄酮溶液浓度达到0.8 mg/mL时，对DPPH自由基清除率最大，表明云南松松针黄酮清除自由基能力在一定浓度范围内呈现量效关系。

3.2云南松松针黄酮类化合物抗脂质过氧化作用

MDA是一种脂质过氧化终产物，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定肝脏受损程度。MDA在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸反应生成红棕色的三甲双酮（3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮），其最大吸收波长在532 nm。用硫代巴比妥酸法考察抗氧化剂对MDA的抑制作用，以此评价抗氧化剂的抗脂质过氧化能力。测定0.1、1.0、5.0 mg/mL 3个质量浓度的云南松松针黄酮溶液对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化产物MDA的抑制作用。见表2。

不同质量浓度的云南松松针黄酮溶液均可抑制大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化反应，并且随着药物浓度增加，抑制作用也逐渐增强。云南松松针黄酮溶液的浓度为0.1 mg/mL时，抑制率达到66.36%，可以看出其具有较好的抗脂质过氧化的能力。

表2 云南松松针黄酮类化合物对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响（

表2 云南松松针黄酮类化合物对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响（

样品 浓度/（mg/m L） 抑制率/%对照管 — —0.1 66.36±0.06云南松松针黄酮溶液1.0 68.93±1.20 5.0 74.33±1.39

4 讨论

近年来，科学工作者通过研究，证明天然黄酮类化合物具有较好的抗脂质过氧化和清除体内自由基的能力。王润丰等〔12〕从野生卷丹百合中提取的黄酮类化合物，质量浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到47.45%；方玉梅等〔13〕从食用甜蕨及苦蕨中提取的黄酮类化合物，质量浓度为12.283μg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到87.13%和50.21%；黄元庆等〔14〕对枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化的研究中，当枸杞总黄酮浓度在0.025~2.000 mg/mL范围时，对MDA的抑制率为38.38%~99.96%。而云南松松针黄酮溶液的质量浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基清除率可达78.67%；云南松松针黄酮溶液质量浓度在0.1~ 5.0 mg/mL范围时，对MDA的抑制率为66.36%~ 74.33%。虽然云南松松针黄酮类化合物清除自由基的能力稍弱于维生素C，但比上文提到的几种天然黄酮类化合物都较强，其抗脂质过氧化作用的效果较好，是一种优良的天然抗氧化剂，具有较高的开发利用价值。

目前，对云南松松针的利用仅限于作燃料或肥料，而云南松松针资源非常丰富，可反复再生利用。研究表明，云南松松针中黄酮类化合物的含量较高，提取率达到7.16%。实验证明云南松松针中黄酮类化合物有较强的抗脂质过氧化和清除体内自由基的作用，说明云南松松针在保健品开发方面具有很高的潜力。本实验针对云南松松针抗氧化能力进行评价，而其抗氧化活性与治疗疾病之间的相关性有待进一步研究。

［参考文献］

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〔4〕李时珍.本草纲目〔M〕.昆明：云南教育出版社，2010.

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〔7〕郭美仙，刘光明，沈磊，等.云南松松塔不同极性部位对不同状态豚鼠离体气管的影响〔J〕.大理学院学报，2015，14（8）：1-4.

〔8〕肖培云，杨永寿，刘光明.云南松松针中总黄酮含量的动态变化〔J〕.中国医药工业杂志，2012，43（2）：97-99.

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〔10〕段志芳，黄晓伟.溪黄草提取物抗脂质过氧化作用研究〔J〕.西北药学杂志，2008，23（2）：93-94.

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〔12〕王润丰，牛立新，张延龙，等.野生卷丹百合黄酮类化合物抗氧化能力的研究〔J〕.西北农业学报，2011，20（11）：152-155.

〔13〕方玉梅，谭萍，王毅红，等.食用甜蕨及苦蕨黄酮类化合物对DPPH自由基的清除效果〔J〕.贵州农业科学，2012，40（6）：52-54.

〔14〕黄元庆，鲁建华.枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究〔J〕.卫生研究，1999，28（2）：115-116.

Antioxidant Effectof Flavonoids Compounds from Pine Needles of Pinus yunnanensis Franch

Fu Wenpeng1,Li Yongfei1,Yang Xiuyun1,Yang Liu1,Yang Yongshou2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the antioxidant activity of flavonoids compounds from pine needles of Pinus yunnanensis Franch and to provide the basis for the utilization of pine needles of Pinus yunnanensis Franch.Methods:Extraction,purification and freezedrying treatments were carried out with ethyl alcohol for dried and grinded pine needles of Pinus yunnanensis Franch;thus total flavonoid extracts were obtained.DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals of flavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch.TBA was used to study the inhibiting effectofflavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch on MDA in the mice liver tissue homogenate.Results:Flavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch had scavenging effect on DPPH and could inhibit the generation of spontaneous liver homogenate lipid peroxidation MDA.Conclusion:The flavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch had a strong anti-oxidanteffect.

pine needles of Pinus yunnanensis Franch;flavonoids;DPPH;antioxidation

R285

A

2096-2266（2017）04-0032-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.009

（责任编辑 李 杨）

大理大学大学生科研基金资助项目（KYSX2015105）；大理大学大学生创新创业训练计划资助项目（CXCY201616）

2016-06-12

2016-09-13

付文鹏，2013级药学专业本科生.

*通信作者：杨永寿，高级实验师.