灯盏花素对Caco-2细胞中P-gp蛋白外排活性的影响

周 玄，曹昌娥，杨 娇，阳美松，邵明园，高洋洋，赖 泳，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

灯盏花素对Caco-2细胞中P-gp蛋白外排活性的影响

周 玄1，曹昌娥1，杨 娇1，阳美松1，邵明园1，高洋洋1，赖 泳1，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：研究灯盏花素对Caco-2细胞中P-糖蛋白（P-gp）外排活性的影响。方法：采用MTT法检测灯盏花素对Caco-2细胞存活率的影响，以确定其试验剂量；通过BCA法测定灯盏花素对Caco-2细胞中总蛋白量的影响，罗丹明123（Rh123）转运试验评价灯盏花素作用后时间对P-gp外排活性的影响。结果：灯盏花素浓度<577.95μg/mL时，Caco-2细胞的存活率>90%；灯盏花素能增加Caco-2细胞中P-gp的外排活性，加入Rh123后，Rh123在Caco-2细胞内的累积量先增加再减少；作用60 min后，灯盏花素（120、240μg/mL）对Caco-2细胞内总蛋白量分别上调222.87%，154.23%。结论：灯盏花素能增加P-gp的外排活性，并上调Caco-2细胞中的总蛋白量。

灯盏花素；P-糖蛋白；Caco-2细胞；罗丹明123

灯盏花素是从灯盏花（菊科飞蓬属植物短葶飞蓬）中提取的黄酮类活性成分〔1-2〕，主要为灯盏甲素和灯盏乙素（野黄芩苷），绝大多数为灯盏乙素。研究表明，灯盏花素具有扩张血管、增加脑血流量和动脉流量、降低血液黏度和外周阻力、抗血小板聚集等药理作用〔3-4〕。P-糖蛋白（P-gp）是由人MDR1基因编码的分子量为170 kDa的外排转运蛋白，属于能量依赖型ABC转运超家族成员，其主要定位于成熟的肠上皮细胞的顶面、肝细胞小管膜、肾和脑血管内皮细胞等组织〔5-6〕。P-gp介导许多外源性化合物的吸收转运过程，其功能活性的改变对药物体内药动学过程具有显著影响〔7-8〕。体外研究表明，灯盏乙素在Caco-2细胞模型中的跨膜转运由P-gp介导〔9-10〕，灯盏花素可能会抑制脑组织中P-gp的表达〔11〕；通过钙黄绿素-AM荧光筛选试验研究人转移性恶性黑色素瘤细胞株WM-266-4中灯盏乙素对P-gp活性的影响，结果显示：灯盏乙素对P-gp表现出弱的抑制作用〔12〕，但尚未明确灯盏花素对Caco-2细胞中P-gp活性的影响。因此，本研究旨在考察灯盏花素对Caco-2细胞中P-gp转运活性的影响，为今后的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器Caco-2细胞（中科院昆明动物研究所细胞库）。DMEM培养基、胎牛血清（FBS，Gibco公司）；双抗、0.25%胰蛋白酶（美国Millipore公司）；MTT（噻唑蓝）、PBS（磷酸缓冲盐溶液）、罗丹明123（Rh123）均购自Solarbio公司；利福平（索莱宝公司）；DMSO（二甲基亚砜，美国Sigma公司）；灯盏花素（Breviscapin，含94.6%的灯盏乙素，云南植物药业有限公司，批号：HB201201）；RIPA裂解液（Beyetime，批号：P0013B，主要成分为50 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1%SDS以及sodium orthovan⁃adate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等）；CO2培养箱（Thermo Scientific）；Purifier Logic+二级生物安全柜（LABCONCO）；Synergy HT多功能酶标仪（美国Bio Tek）；荧光分光光度计（960MC，上海精科）。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 将Caco-2细胞接种于75 cm2的培养瓶中，加入10~15 mL DMEM培养基（含1%双抗和10%FBS），37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞处于对数期生长（细胞融合率80%~ 90%）时，0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 细胞毒性实验（MTT法） 取对数生长期细胞，以1×105个/mL的密度接种于96孔板，每孔终体积100μL，分为阴性对照组、空白对照组及实验组，空白对照组不接种细胞。37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后，去除每孔培养液，用PBS洗涤2遍。实验组加入不同浓度的灯盏花素（溶于DMEM中）200μL，阴性对照组和空白对照组加入200μL空白培养基。37℃，5%CO2培养箱中分别培养24、48、72 h后，PBS清洗2遍，每孔加20μL的MTT（5 mg/mL）继续孵育4 h，终止培养，每孔加150μL DMSO，振荡10 min使结晶物充分溶解。空白对照组调零后，用酶标仪测490 nm处的吸光度值（A），按下式计算细胞存活率（cellsurvivalrate），存活率大于90%可认为该浓度的灯盏花素对细胞生长无显著影响。

1.2.3 灯盏花素作用后时间对Rh123摄取的影响

Caco-2细胞用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，离心（1 000 r/min，5 min）弃上清后，PBS分散成细胞数为1×106个/mL的单细胞悬液，取0.5 mL接种入1.5 mL灭菌的EP管中。空白对照组、阳性对照组和实验组先分别加入500μL的PBS、利福平溶液（溶于DMEM中，10μmol/L）和灯盏花素溶液（120μg/mL、240μg/mL），37℃，5%CO2培养箱中培养60 min后，置冰上终止反应，4℃离心（2 500 r/min，15 min）弃上清，冰冷的PBS洗2次（每次1 mL），4℃离心（2 500 r/min，15 min）弃上清，再分别加入120μmol/L的Rh123（溶于DMEM中）溶液10μL，37℃、5%CO2培养箱中培养（20、40、60、80、100 min），每到1个时间点，随机取出1批细胞，置冰上终止作用，4℃离心（2 500 r/min，15 min）弃上清，冰冷的PBS洗2次（每次1 mL），4℃离心（2 500 r/min，15 min）弃上清。加入50μL细胞裂解液，充分混匀，置冰上30 min，4℃离心（12 000 r/min，15 min）。取20μL上清，加入1 980μL PBS混匀后，用荧光分光光度计测定吸收值（激发波长：466 nm，发射波长：535 nm）。

1.2.4 灯盏花素对Caco-2细胞中总蛋白量的影响

取利福平和灯盏花素处理60 min后的Caco-2细胞，加入50μL细胞裂解液，充分混匀，置冰上30 min， 4℃离心（12 000 r/min，5 min），取上清液用BCA法测定蛋白量。

1.2.5 统计学处理 实验结果采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间比较用one-way ANOVA检验，各组数据以（xˉ±s）表示。

2 结果

2.1灯盏花素对Caco-2细胞的毒性2 311.80，577.95，144.49，36.12，36.12，9.03和2.28μg/mL的灯盏花素分别与Caco-2细胞共孵育作用24、48及72 h后，除2 311.80μg/mL以外，其他浓度下细胞存活率均大于90%。表明浓度低于577.95μg/mL时，灯盏花素对Caco-2细胞无明显毒性作用，故选用120、240 μg/mL的灯盏花素进行下一步研究。见表1。

表1 灯盏花素不同浓度下Caco-2细胞的存活率

表1 灯盏花素不同浓度下Caco-2细胞的存活率

药物灯盏花素浓度/（μg/mL）2 311.80 577.95 144.49 36.12 9.03 2.28细胞存活率/% 24 h 51.54±6.42 91.04±2.24 92.53±3.08 94.96±3.23 91.04±2.67 91.41±1.13 48 h 36.51±0.84 90.85±1.17 94.57±2.11 94.19±2.59 91.86±1.23 91.86±1.63 72 h 48.52±6.21 90.33±0.81 92.83±3.02 94.38±0.98 93.60±2.20 92.55±3.03

2.2灯盏花素作用后时间对Caco-2细胞胞内Rh123累积量的影响利福平、灯盏花素（120、240μg/mL）与Caco-2细胞共孵育60 mim后加入Rh123，与空白对照组相比，20 min时Rh123在胞内累积量分别减少16.64%，38.38%，22.12%（P<0.01）；40 min时Rh123在胞内累积量分别减少58.81%，52.19%，38.51%（P<0.01）；60 min时Rh123在胞内累积量分别减少78.81%，75.19%，70.69%（P<0.01）；80 min时Rh123在胞内累积量分别减少60.17%，61.74%，52.45%（P<0.01）；100 min时Rh123在胞内累积量分别减少20.56%，14.34%，34.94%（P<0.01）；120 min时Rh123在胞内累积量分别减少9.64%（P<0.01），1.16%，21.32%（P<0.01）。以上结果表明，灯盏花素能增加Caco-2细胞中P-gp的外排活性；加入Rh123后，其在Caco-2细胞内的累积量先减少再增加，其中，高浓度（240μg/mL）对Caco-2细胞中P-gp的作用较强。见图1。

图1 灯盏花素作用后时间对Caco-2细胞内Rh123累积量的影响（

2.3灯盏花素对Caco-2细胞中总蛋白量的影响

利福平（10μmol/L）、灯盏花素（120、240μg/mL）作用于Caco-2细胞60 min后，与空白对照组相比，细胞内总蛋白量分别上调123.60%，222.87%，154.23%（P<0.01）。由此可见，灯盏花素对Caco-2细胞中蛋白的表达具有诱导作用。见图2。

图2 灯盏花素对Caco-2细胞中总蛋白量的影响

3 讨论

灯盏花素临床上常作为辅助药物与其他西药联合用于心、脑血管疾病的治疗，如冠心病、心绞痛、缺血性血管疾病损伤、脑栓塞等〔4〕。据文献报道，灯盏乙素能抑制人肝微粒体CYP450酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4等）及大鼠肝微粒体CYP450酶（CYP2C7、CYP2C11、CYP2D4、CYP3A1等）活性〔9，12〕。灯盏花素可能会抑制脑组织中P-gp的表达〔11〕，而灯盏花素对Caco-2细胞中P-gp活性的影响尚未明确。故本研究对灯盏花素对Caco-2细胞中P-gp活性的影响进行研究。

本实验采用120、240μg/mL的灯盏花素分别与Caco-2细胞共孵育，通过测定Caco-2细胞内P-gp底物Rh123的荧光强度来表示其累积量，以反映P-gp转运活性的改变。结果显示，共孵育60 min后，Caco-2细胞中P-gp的外排转运活性增强；加入Rh123后，P-gp的转运活性随时间发生改变；其中，高浓度（240μg/mL）对Caco-2细胞中P-gp的作用较强。P-gp抑制剂可通过改变P-gp构象逆转多药耐药，也可通过与其底物竞争P-gp结合位点阻断药物的外排〔13〕，从而短时间内即可产生作用。灯盏乙素在Caco-2细胞模型中的跨膜转运由P-gp介导〔9-10〕。灯盏花素与Caco-2细胞共孵育60 min后，灯盏花素对Caco-2细胞的作用达到平衡，Caco-2细胞中P-gp的外排活性增加，Rh123在Caco-2细胞内的累积量减少，60 min时达到最低。当加入P-gp底物Rh123后，Rh123将与灯盏花素竞争P-gp的结合位点，从而破坏已有平衡，使得Caco-2细胞中P-gp的外排活性逐渐降低，导致Rh123在Caco-2细胞内的累积量又逐渐增加。灯盏花素高浓度（240μg/mL）时的变化趋势相较于低浓度（120μg/mL）要缓，可能是灯盏花素高浓度时更能保持已有平衡。灯盏花素（120、240μg/mL）作用于Caco-2细胞60 min后，细胞内总蛋白量分别上调222.87%，154.23%，结合灯盏花素能使Caco-2细胞内Rh123的累积量减少，推测P-gp的量可能增加。但灯盏花素对P-gp蛋白表达量的影响还需进一步研究。

由于P-gp底物比较宽泛（如蒽环类和多肽类抗生素、生物碱、类固醇类激素、局麻药等），且底物间化学结构及性质差异很大〔14〕，因此，单一底物所得的结果可能并不准确，仍需进一步验证其他类型的P-gp底物作为探针时，灯盏花素对P-gp活性的影响；同时灯盏花素与其他药物可能的药物相互作用也值得深入研究。综上，灯盏花素短时间内（60 min）就能增强Caco-2细胞中P-gp的外排活性并上调胞内总蛋白量。结果提示，灯盏花素与P-gp底物共同使用时可能产生潜在相互作用，这将为临床合理用药提供实验性参考依据。

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Effectof Breviscapin on the Efflux Activity of P-gp in Caco-2 Cells

Zhou Xuan1,Cao Chang'e1,Yang Jiao1,Yang Meisong1,Shao Mingyuan1,Gao Yangyang1,Lai Yong1,2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the effect of breviscapin on the efflux activity of P-gp in Caco-2 cells.Methods:Cellsurvival rate of Caco-2 cells with differentbreviscapin concentrations were measured by MTT assay.The BCA assay was used to determine the total protein level of Caco-2 cells and the efflux activity of P-gp was determined by Rhodamine-123 assay after the incubation with breviscapin.Results:The cell survival rate of Caco-2 cells was higher than 90%when the concentration ofbreviscapin was less than 577.95μg/mL.The efflux activity of P-gp was increased by breviscapin（120μg/mL,240μg/mL）in Caco-2 cells.The intracellular accumulation of rhodamine-123 was increased and then decreased after the addition of rhodamine-123.After the incubation for 60 min with breviscapin（120μg/mL,240μg/mL）,total protein level in Caco-2 cells was up-regulated 222.87%,154.23%respectively.Conclusion:Breviscapin can up-regulate totalprotein leveland increase the efflux activity of P-gp in Caco-2 cells.

Breviscapin;P-gp;Caco-2 cell;Rhodamine-123

R285

A

2096-2266（2017）04-0020-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.006

（责任编辑 李 杨）

国家自然科学基金资助项目（81241139；81360511）；云南省教育厅科学研究基金资助项目（2013J118）

2016-08-19

2016-11-08

周玄，硕士研究生，主要从事体内药物分析研究.

*通信作者：赖泳，教授.