云南松松针多糖清除自由基及抗脂质过氧化活性研究

李永飞，付文鹏，丁 路，马增艳，杨永寿

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

云南松松针多糖清除自由基及抗脂质过氧化活性研究

李永飞1，付文鹏1，丁 路1，马增艳1，杨永寿2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：研究云南松松针多糖清除自由基及抗脂质过氧化的活性。方法：采用DPPH法研究云南松松针多糖清除自由基的能力，用硫代巴比妥酸（TBARS）法研究云南松松针多糖对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的抑制作用，并与维生素C的抗氧化作用进行对比，评价其抗脂质过氧化能力。结果：云南松松针多糖对DPPH自由基有较好的清除能力，能抑制肝组织匀浆自发性脂质过氧化产物MDA的产生。结论：云南松松针多糖对DPPH自由基有清除作用，对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化有抑制作用，表明云南松松针多糖有较好的抗氧化作用。

云南松松针多糖；DPPH自由基；抗氧化；脂质过氧化

云南松（Pinus yunnanensis Franch.），又称飞松、长毛松、青松，为松科松属常绿乔木。主要分布于云南、西藏、四川、贵州等省区〔1〕。松针的药用历史悠久，明《本草纲目》、魏晋《名医别录》、汉《别录》、《日华子本草》等历史文献明确记载我国用松针来治疗疾病，历史文献中松针有祛风燥湿、杀虫止痒等功效，治疗风湿关节痛、跌打肿痛、夜盲症、高血压，提高免疫力。目前人们对松针的化学成分（糖类、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量矿物元素、维生素、抗菌素、生物黄酮类物质、莽草酸、精油、叶绿素、木脂素、不饱和脂肪酸、酶与辅酶等〔2〕）、毒理、病理、药理、生理等方面做了基础研究工作，并取得丰硕的成果〔3〕。但松针的应用多局限于食用、饲用、生产化工原料等方面，因此应对丰富的松针资源的药用价值进一步开发利用。本研究从云南松松针中提取分离得到多糖提取物，采用 DPPH法〔4〕与TBARS法〔5〕相结合，系统研究多糖提取物清除氧自由基能力和抗脂质过氧化的作用效果，并与维生素C的抗氧化性相对比，为云南松松针的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 材料 云南松松针采自云南省大理市大理苍山；SD昆明大鼠，180~220 g，由昆明医科大学实验动物中心提供（批号：43004700017373）。

1.1.2 试剂 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，东京化成工业株式会社，批号：217-591-8）；硫代巴比妥酸（TBARS，国药集团化学试剂有限公司，批号：20150123）；维生素C（上海化学试剂分装厂，批号：84-01-10）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2仪器UV2500紫外可见分光光度计（日本岛津）；LC-4012型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AL204-IC型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；DFY-200型摇摆高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）；D2KW-4型恒温水浴锅（上海科析试验仪器厂）；FDU-2100型冷冻干燥机（东京理化）；101A-2B电热鼓风干燥箱（上海崇明实验仪器厂）。

2 实验方法

2.1松针多糖的提取云南松松针采集后，除杂并切为5~6 cm长，于60℃干燥17 h，自然冷却，粉碎，备用。以水为溶剂，按料液比1：10（g/mL）进行回流提取2 h，过滤，取滤液减压浓缩、石油醚脱脂脱色，回收石油醚，水层转移至1 000 mL烧杯，加5倍量95%乙醇醇沉24 h，离心沉降，取沉淀，反复溶解精制2次，得白色沉淀，取提取物加适量蒸馏水溶解，加一定量的氯仿和正丁醇萃取2~3次进行脱蛋白。将萃取后的溶液减压浓缩、冷冻干燥，得白色粉末，即为松针多糖提取物，低温保存备用〔6〕。

2.2溶液的配制

2.2.1 供试品溶液的配制 精密称取“2.1”项制备的松针多糖提取物适量，用蒸馏水配置成1 mg/mL的储备液，用蒸馏水稀释成0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的测试液。

2.2.2 DPPH溶液的配制 精密称取DPPH 2.2 mg，用无水乙醇配制0.2 mmol/L的溶液，临用新配。

2.2.3 10%硫代巴比妥酸溶液的配制 精密称取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中，加少量1 mol/L NaOH溶液溶解，再用10%三氯乙酸定容至刻度，摇匀，即得，临用新配。

2.2.4 维生素C溶液的配制 精密称取维生素C 1.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，定容，摇匀，即得浓度为0.01 mg/mL的储备液，临用新配，用时用水稀释成不同浓度的测试液。

2.3云南松松针多糖对DPPH自由基的清除作用

实验在10 mL棕色容量瓶进行，分为空白管、对照管、药物底管及药物管，药物底管和药物管中精密加入样品溶液1.0 mL，空白管和药物底管精密加入2.0 mL无水乙醇，对照管和药物管中精密加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，密封，混匀，暗处放置30 min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，于517 nm下测定吸光度值，按下式计算自由基的清除率：

DPPH·清除率：I（%）=［1－（A样品－A空白）/A对照］×100%

2.4云南松松针多糖对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用将禁食12 h健康大鼠麻醉后，迅速取肝脏，剪去脂肪及筋膜组织，用预冷的生理盐水洗净，滤纸吸干水分，称重后，剪碎。以生理盐水为匀浆介质，用玻璃匀浆器在冰水浴中研磨制得10%大鼠肝匀浆（肝脏：生理盐水=1：9），低温3 000 r/min离心10 min，取上清液于冰箱中冷冻备用〔7〕。实验分为空白管、对照管、药物底管及药物管，各管所加试剂见表1。

表1 自发性脂质过氧化试验加样表

将各管摇匀，于37℃恒温水浴振荡1 h，对照管和药物管分别加入10%硫代巴比妥酸溶液2.0 mL，各管在80℃恒温水浴加热15 min，冷却，3 000 r/min离心10 min，以空白校正，取上清液于532 nm处测定吸光度值，平行操作3次，按下式计算抑制率：

I（%）=［A对-（A药物管-A药物底管）］/A对×100%

其中：A对为对照管的吸光度，A药物管为加入药物溶液的吸光度，A药物底管为不加大鼠肝组织匀浆药物溶液本底的吸光度。

3 结果

3.1维生素C对DPPH的清除作用维生素C具有很强的抗氧化活性，常被用来作为评价抗氧化能力强弱的参照〔8〕。用“2.2.3”项方法测定维生素C对DPPH自由基的清除曲线。见图1。根据计算，IC50值为0.033 6 mg/mL。

图1 维生素C对DPPH自由基的清除曲线

3.2云南松松针多糖对DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，其无水乙醇溶液在517 nm处有最大吸收。DPPH自由基与松针多糖溶液反应后，DPPH自由基的量会减少，在517 nm处的吸光度值会降低，通过计算反应后DPPH自由基的清除率评价抗氧化剂的抗氧化能力〔9〕。云南松松针多糖对DPPH自由基清除曲线见图2。

图2 云南松松针多糖对DPPH自由基清除曲线

由云南松松针多糖对DPPH自由基清除曲线可知，云南松松针中多糖对DPPH自由基有较强清除能力，但弱于维生素C。随多糖浓度的增大，其自由基清除率也增大，当多糖溶液浓度达到1.0 mg/mL时对自由基清除能力63.59%，明显减缓，由此可推测当多糖达到一定浓度时，其清除能力达到最大。用SPSS软件分析数据得出松针多糖对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）为0.6 mg/mL。

3.3云南松松针多糖抗脂质过氧化作用丙二醛（MDA）是一种脂质过氧化终产物，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。MDA在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBARS）反应生成红棕色的三甲双酮（3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮），其最大吸收波长在532 nm。用TBARS法考察抗氧化剂对MDA的抑制作用，以此评价抗氧化剂抗脂质过氧化活性〔10〕。测定0.1、0.6、1.0 mg/mL 3个浓度的云南松松针中多糖对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化产物MDA的抑制作用。见表2。

表2 云南松松针多糖对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响

表2 云南松松针多糖对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响

组别对照管云南松松针多糖溶液质量浓度/（mg/m L）—0.1 0.6 1.0抑制率/%—14.70±1.92 31.01±1.84 49.73±1.06

随着多糖浓度增加，对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化抑制作用也逐渐增强。当多糖溶液的浓度为1.0 mg/mL时，抑制率为49.73%，可见云南松松针多糖具有一定的抗脂质过氧化作用，但作用不强。

4 讨论

以维生素C作对照，测定松针多糖对DPPH自由基的清除能力及抗脂质过氧化能力，评价其抗氧化活性。实验结果表明，云南松松针多糖具有一定的抗氧化活性，对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化有一定的抑制作用和抗氧化能力，在一定质量浓度范围内，对DPPH自由基的清除能力都呈现一定的量效关系，但其清除率弱于维生素C。

目前，松针的应用情况有松针酒、松针茶、保健饮品、畜牧饲料、香料提取和化工产品制备等。国内利用松针中生物活性物质的功效试制出的产品有松针口服糖浆、护肤美容膏、护肤冻疮膏、松针跌打油等〔11〕。但是松针内的很多功能性成分并没有得到开发和利用，如松针具有镇痛、抗炎、镇咳祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抑菌等作用〔12〕，并没有相关制剂开发。云南松为西南地区的乡土树种，也是荒山绿化造林先锋树种，有着丰富的资源和开发利用潜力。松针是可持续利用的再生资源，不受季节影响，来源广泛。植物多糖对人体有独特的保健功效，许多植物多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗感染、抗溃疡等多种生理功能〔12〕。因此云南松松针在保健品开发和制药方面具有很好的发展前景和潜力。

［参考文献］

〔1〕中国科学院昆明植物研究所.云南植物志：第4卷〔M〕.北京：科学出版社，1986.

〔2〕刘晓庚，陈梅梅.我国松针的开发利用研究及进展〔J〕.林产化工通讯，2003，37（4）：29-34.

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〔4〕LIU J K，HU L，DONG Z J，et al.DPPH radical scavenging activity of ten natural p-terphenyl derivatives obtained from three edible mushrooms indigenous to China〔J〕. Chem Biodivers，2004，1（4）：601-605.

〔5〕唐霞光，张春妹，刘嘉，等.美洲大蠊不同提取物清除自由基及抗脂质过氧化活性研究〔J〕.食品工业科技，2016，37（13）：83-85.

〔6〕许小向，洪艳平，胡捷敏，等.松针多糖提取工艺及稳定性研究〔J〕.食品科技，2015（6）：218-223.

〔7〕梁启明，徐扬，王艳珍，等.安络小皮伞菌丝体多糖的提取及其抗脂质过氧化作用的研究〔J〕.食品工业科技，2007，28（9）：127-129.

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〔10〕许长成，邹琦，程炳嵩.硫代巴比妥酸（TBA）法检测脂质过氧化水平的探讨〔J〕.植物生理学通讯，1989（6）：58-60.

〔11〕陈英，刘成国，赵毓芝，等.松针功能性成分及应用研究进展〔J〕.安徽农业科学，2012，40（10）：5994-5996.

〔12〕李萍，刘友平.松针研究进展〔J〕.成都中医药大学学报，2001，24（3）：49-50.

Research on Pinus yunnanensis Franch Pine Needle Polysaccharide's Effectof Scavenging Free Radical and Anti-lipid Peroxidation

Li Yongfei1,Fu Wenpeng1,Ding Lu1,Ma Zengyan1,Yang Yongshou2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide's effect of scavenging free radical and antilipid perxidation.Methods:DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals of Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide.TBARS was used to study the inhibition effect of Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide on MDA in the mice liver tissue homogenate.The effect was compared with the antioxidation of vitamin C,and its anti lipid peroxidation ability was evaluated as well.Results:Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide extract had certain scavenging effect on DPPH and could inhibit MDA in the mice liver tissue lipid oxidation products of spontaneous generation.Conclusion:Pinus yunnanensis Franch pine needle polysaccharide extract has scavenging effects on DPPH free radicals,and inhibition effect on rat liver homogenate spontaneous lipid peroxidation,showing that Pinus yunnanensis Franch pine needles polysaccharide has good anti-oxidation action.

Pinus yunnanensis Franch pine needles polysaccharide;DPPHfree radical;lipid perxidation;antioxidant

R285

A

2096-2266（2017）04-0028-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.008

（责任编辑 李 杨）

大理大学大学生科研基金资助项目（KYSX2015105）；大理大学大学生创新创业计划资助项目（CXCY201616）

2016-06-12

2016-09-23

李永飞，2013级药学专业本科生.

*通信作者：杨永寿，高级实验师.