长果颈黄芪根中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

邱 琳，肖朝江，董 相，姜 北*

（1.大理大学药物研究所，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

长果颈黄芪根中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

邱 琳1，2，肖朝江1，2，董 相1，2，姜 北1，2*

（1.大理大学药物研究所，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

目的：对长果颈黄芪（Astragalus englerianus）根化学成分进行研究，并对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测试。方法：利用Rp-18、Sephadex LH-20、硅胶等分离手段对长果颈黄芪根部分的甲醇提取物进行分离纯化，通过现代波谱学技术对相关化合物进行结构鉴定，并以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物的酶抑制剂筛选模型对各样品进行α-葡萄糖苷酶抑制活性实验。结果：从该植物根甲醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到6个化合物，分别鉴定为：十六烷酸单甘油酯（1）、2，4'-二羟基-4-甲氧基二氢查耳酮（2）、胡萝卜苷（3）、5α，6β-二羟基胡萝卜苷（4）、（3R）-vestitol-7-O-glucoside（5）、（2S，3S，4R，8E）-2-［（2'R）-2'-羟基-二十四烷酰胺］-8-十八烯-1，3，4-三醇（6）。α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，化合物2具有显著抑制活性，IC50显著小于阳性对照阿卡波糖；化合物5及其苷元（3R）-vestitol也显示一定的抑制活性。结论：化合物1~6均为首次从长果颈黄芪根中分离得到，其中黄酮类成分对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性。

长果颈黄芪；根；化学成分；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

长果颈黄芪（Astragalus englerianus）为我国特有的豆科黄芪属植物，主要分布于云南、西藏东南部等地区，生于海拔2 000～3 700 m的山坡林缘。民间药用记载该植物根入药，有滋肾补脾、止汗利水、消肿化脓之效〔1-2〕。为了解该植物的化学成分与生物活性，本研究团队曾对该植物进行过系统的研究，分离得到了一系列结构类型多样的活性成分〔3-4〕。由于黄芪属植物多具有血糖调节作用，为该研究的后续工作，近来我们对长果颈黄芪地下部分甲醇提取物乙酸乙酯部位进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性成分研究，从中分离鉴定了6个化合物，分别为：十六烷酸单甘油酯（1）、2，4'-二羟基-4-甲氧基二氢查耳酮（2）、胡萝卜苷（3）、5α，6β-二羟基胡萝卜苷（4）、（3R）-vestitol-7-O-glucoside（5）、（2S，3S，4R，8E）-2-［（2'R）-2'-羟基-二十四烷酰胺］-8-十八烯-1，3，4-三醇（6）。见图1。活性测试结果显示，化合物2对α-葡萄糖苷酶有很好的抑制活性，IC50显著小于阳性对照阿卡波糖，化合物5及其苷元（3R）-vestitol也显示一定的抑制活性。本研究为长果颈黄芪的开发利用提供了初步的基础性研究依据。

图1 化合物1~6的结构

1 仪器与材料

1.1实验材料实验用植物样品于2011年11月采自云南省大理市苍山东坡，由中国科学院昆明植物研究所向春雷博士鉴定为长果颈黄芪Astragalus englerianus Ulbr.，植物标本（编号：20100928-1b）现存放于大理大学药物研究所姜北教授研究组〔3〕。

1.2仪器与试剂Bruker Avance III-400核磁共振波谱仪（TMS为内标）；旋转蒸发仪R-210（BUCHI）；BioTek Synergy HT酶标仪（BioTek Instruments Inc.）；RP-18（40～75μm，日本Fuji公司）；Sephadex LH-20（Amersham Biosciences）；柱色谱硅胶与薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；α-Glucosidase from rice（G9259-100UN）和4-Nitrophenylα-D-glucopyrano⁃side（N1377-1G）均购于Sigma公司；阿卡波糖（北京百灵威科技有限公司）；氯仿、丙酮、甲醇等试剂均为工业级有机溶剂，经重蒸后使用；其余试剂均为分析纯；供试样品（3R）-vestitol由本研究组前期研究中分离得到〔5〕。

2 实验方法

2.1提取分离长果颈黄芪干燥根（6.1 kg）粉碎后用甲醇室温冷浸提取6次，减压浓缩所得总浸膏用适量水混悬后依次用乙酸乙酯、正丁醇分配数次；乙酸乙酯部分减压浓缩得浸膏100 g，与适量粗硅胶（80~100目）混合拌样后经200~300目硅胶柱色谱，氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗脱（1：0至0：1），经TLC（薄层色谱法）检测合并相同流分得10个组分（A~J）〔3〕。组分D经Sephadex LH-20（氯仿：甲醇= 1：1）柱层析以及硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯）得到化合物1（22.6 mg）。组分E经硅胶柱层析（氯仿-甲醇），Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱层析和Rp-18（甲醇-水）柱层析得到化合物2（41.1 mg）、3（277.0 mg）和4（34.3 mg）。组分F经大孔树脂（甲醇-水）、Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱层析以及反复硅胶柱层析（氯仿-丙酮、氯仿-甲醇）的方法得到化合物5（121.4 mg）、6（56.0 mg）。

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定α-葡萄糖苷酶抑制活性测定的反应体系参照MA等〔6〕的方法，并略有改进：分别配制100 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）、2 mmol/L PNPG溶液（PBS溶解）、0.3 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液（PBS溶解）以及0.2 mol/L Na2CO3溶液；测试样品根据预试验结果用DMSO（二甲基亚砜）配置成合适的初始浓度，共设置5个浓度梯度，采用倍比稀释法稀释成测试浓度；取96孔板，每孔加40μL的PNPG溶液和5μL样品溶液，震板30 s后加入5μL的α-葡萄糖苷酶溶液，在37℃恒温水浴20 min，加入50μL的Na2CO3溶液终止反应，冷却至室温后在酶标仪下以405 nm为测定波长，630 nm为参比波长测定吸收值并按下式计算抑制率。实验一式5份，同时设置空白对照（DMSO）和阳性对照（阿卡波糖）。

抑制率%=［（△A空白-△A样品）/△A空白］×100%；△A=样品组OD值-背景组OD值

2.3数据处理方法采用SPSS 7.0统计软件对活性测试结果进行数据分析。

3 实验结果

3.1结构鉴定化合物1：白色粉末。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：2.37（2H，t，J=7.42 Hz，H-2），1.62（2H，brs，H-3），1.29（16H，brs，H-4~15），4.16（1H，dd，J=11.4，4.4 Hz，H-1'a），4.07（1H，dd，J=11.4，6.3 Hz，H-1'b），3.85（1H，m，H-2'），3.57（1H，d，J=5.9 Hz，H-3'a），3.31（1H，d，J=5.7 Hz，H-3'b），0.90（3H，t，J=6.2 Hz，Me-16）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：175.8（s，C-1），35.2（t，C-2），33.2（t，C-3），30.2~30.3（t，C-4~14），23.9（t，C-15），14.8（q，C-16）。上述数据与文献〔7〕报道的碳、氢谱数据基本一致，取标准品十六烷酸单甘油酯点板对照，其Rf值与斑点颜色均与标准品一致，故确定化合物1为十六烷酸单甘油酯。

化合物2：浅黄色粉末。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.87（2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6'），6.84（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），6.84（2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5'），6.50（1H，d，J=2.6 Hz，H-3），6.44（1-H，dd，J=8.4，2.6 Hz，H-5），3.73（3H，s，H-OCH3），3.34（2H，t，J=5.6Hz，H-α），2.92（2H，t，J=5.6 Hz，H-β）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：120.3（s，C-1），155.3（s，C-2），102.8（d，C-3），159.6（s，C-4），107.1（d，C-5），131.1（d，C-6），128.9（s，C-1'），131.1（d，C-2'，C-6'），115.5（d，C-3'，C-5'），161.2（s，C-4'），201.2（s，C=O），40.2（t，C-α），22.9（t，C-β），55.3（q，OCH3）。上述数据与文献〔8〕报道的波谱数据基本一致，故确定化合物2为2，4'-二羟基-4-甲氧基二氢查耳酮。

化合物3：白色粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.36（1H，d，J=4.3 Hz，H-6），5.03（1H，d，J=7.7 Hz，H-1'），4.58（1H，dd，J=12.2，2.5 Hz，H-6'a），4.43（1H，dd，J=12.2，5.2 Hz，H-6'b），4.29（1H，d，J=6.8 Hz，H-4'），0.93（1H，d，J=6.6 Hz，Me-21），0.89（3H，s，Me-19），0.85，0.81 and 0.79（each 3H，overlap，Me-26，27 and 29），0.67（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：37.9（t，C-1），30.8（t，C-2），78.9（d，C-3），40.6（t，C-4），141.2（s，C-5），122.4（d，C-6），32.7（t，C-7），32.6（d，C-8），50.8（d，C-9），37.4（s，C-10），21.8（t，C-11），39.8（t，C-12），42.9（s，C-13），57.3（d，C-14），24.9（t，C-15），29.1（t，C-16），56.7（d，C-17），12.5（q，C-18），19.7（q，C-19），36.9（d，C-20），19.5（q，C-21），34.7（t，C-22），26.9（t，C-23），46.5（d，C-24），29.9（d，C-25），20.5（q，C-26），19.9（q，C-27），23.9（t，C-28），12.7（q，C-29），103.1（d，C-1'），75.8（d，C-2'），78.6（d，C-3'），72.0（d，C-4'），79.1（d，C-5'），63.3（t，C-6'）。上述数据与文献〔9〕报道的波谱数据一致，故确定化合物3为胡萝卜苷。

化合物4：白色粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：4.88（1H，d，J=7.5 Hz，H-1'），4.38（1H，dd，J=12.1，2.3 Hz，H-6'a），4.29（1H，dd，J=12.1，4.8 Hz，H-6'b），4.25（1H，t，J=9.0 Hz，H-4'），4.16（1H，t，J=8.9 Hz，H-3'），4.11（1H，brs，H-6），2.98（1H，dd，J=12.1，4.5 Hz，H-4a），2.58（1H，m，H-4b），1.33（3H，s，Me-19），0.96（3H，m，Me-21），0.87（3H，m，Me-27），0.80（3H，m，Me-26），0.66（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：33.3（t，C-1），31.9（t，C-2），75.9（d，C-3），39.3（s，C-4），76.2（s，C-5），76.5（d，C-6），36.4（d，C-7），31.6（t，C-8），46.2（d，C-9），39.3（t，C-10），23.2（t，C-11），41.4（t，C-12），43.4（t，C-13），57.2（d，C-14），25.1（d，C-15），30.0（d，C-16），56.9（d，C-17），12.4（q，C-18），17.4（q，C-19），37.2（s，C-20），19.4（q，C-21），34.7（t，C-22），27.3（t，C-23），46.2（t，C-24），30.1（t，C-25），19.9（q，C-26），20.5（t，C-27），23.9（t，C-28），12.7（C-29），102.9（d，C-1'），75.3（d，C-2'），76.9（d，C-3'），72.5（d，C-4'），77.9（d，C-5'），63.3（t，C-6'）。上述数据与文献〔10〕报道的波谱数据基本一致，故确定化合物4为5α，6β-二羟基胡萝卜苷。

化合物5：针状结晶（甲醇）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.95（1H，d，J=8.5 Hz，H-6'），6.94（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.59（1H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-5'），6.53（1H，d，J=2.4 Hz，H-3'），6.36（1H，dd，J=8.4，2.5 Hz，H-6），6.33（1H，d，J=2.5 Hz，H-8），4.81（1H，d，J=7.4 Hz，H-1''），4.20（1H，ddd，J=10.3，3.4，1.9 Hz，H-2a），3.96（1H，d，J=10.3 Hz，H-2b），3.86（1H，d，J=1.9 Hz，H-6'），3.70（3H，s，-OMe），3.86（1H，d，J=4.8 Hz，H-5''），2.94（1H，dd，J=15.8，10.8 Hz，H-4a），2.80（1H，ddd，J=15.8，5.3，1.9 Hz，H-4b）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：71.1（t，C-2），33.0（d，C-3），31.4（t，C-4），131.2（d，C-5），110.1（d，C-6），158.3（s，C-7），105.6（d，C-8），156.3（s，C-9），117.9（s，C-10），121.1（s，C-1'），157.2（s，C-2'），102.4（d，C-3'），160.8（s，C-4'），105.7（d，C-5'），128.8（d，C-6'），55.6（q，-OMe），102.4（d，C-1''），74.9（d，C-2''），78.0（d，C-3''），71.3（d，C-4''），78.1（d，C-5''），62.5（t，C-6''）。上述数据与文献〔11〕报道的波谱数据基本一致，故确定化合物5为（3R）-vestitol-7-O-glucoside。

化合物6：白色粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：8.60（1H，d，J=9.0 Hz，NH），5.54（2H，m，H-8，9），5.13（1H，m，H-2），4.64（1H，dd，J=7.8，3.8 Hz，H-2'），4.53（1H，dd，J=10.8，4.6 Hz，H-1a），4.44（1H，dd，J=10.8，4.9 Hz，H-1b），4.35（1H，dd，J=6.9，4.4 Hz，H-3），4.30（1H，m，H-4），1.16~2.36（m，H-11~17，5'~23'），0.88（6H，t，J= 7.0 Hz，H-18，24'）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：61.8（t，C-1），52.7（d，C-2），76.6（d，C-3），72.6（d，C-4），33.6（t，C-5），26.5（t，C-6），32.8（t，C-7），130.4（d，C-8），130.6（d，C-9），33.1（t，C-10），29.3-29.8（t，C-11~15），31.9（t，C-16），22.7（t，C-17），14.1（q，C-18），175.0（s，C-1'），72.2（d，C-2'），35.5（t，C-3'），25.6（d，C-4'），29.3-29.8（t，C-5'~21'），31.9（t，C-22'），22.7（t，C-23'），14.1（q，C-24'）。上述数据与文献〔12〕报道的波谱数据基本一致，并取标准品点板对照，以3个不同的溶剂系统分别展开，其Rf值与斑点颜色均与标准品一致，故确定化合物6为（2S，3S，4R，8E）-2-［（2'R）-2'-羟基-二十四烷酰胺］-8-十八烯-1，3，4-三醇。

3.2受试样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定结果

对长果颈黄芪根甲醇提取物、提取物乙酸乙酯萃取部位、化合物1~6及化合物5的苷元（3R）-vestitol进行α-葡萄糖苷酶的抑制活性检测，其中甲醇提取物、乙酸乙酯部分初始浓度为5 mg/L，各单体化合物初始浓度为1 mg/L，在初始浓度下仍未显示出对α-葡萄糖苷酶有抑制活性，则认为该化合物没有活性。实验结果表明：类属于黄酮的化合物2活性最好，化合物5的苷元（3R）-vestitol次之，化合物5活性较弱，其余化合物均没有显示对α-葡萄糖苷酶有抑制活性，相关试验结果见表1。

4 讨论

本实验从长果颈黄芪中分离得到的6个化合物，结构类型涉及黄酮、甾体、酰胺和酯类成分等。α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果显示，仅黄酮类化合物具有抑制活性，而酯类、甾体类及酰胺都不具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。同时，化合物5的α-葡萄糖苷酶抑制活性明显弱于相应苷元（3R）-vestitol，说明其结构中的酚羟基被糖基化后会降低化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，这与文献〔13〕报道相一致。化合物2为二氢查耳酮类化合物，TSUJIHARA等研究发现同类化合物根皮苷及其衍生物具有抑制钠糖转运通道（SGLT）活性〔14〕。这类化合物可以通过抑制SGLT活性，促进尿糖代谢，从而达到降低血糖的目的。本实验研究结果进一步显示二氢查耳酮类化合物也可与α-葡萄糖苷酶的活性位点相结合，从而达到抑制其活性的目的。

表1 受试样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性试验结果（n=5）

〔1〕《中国植物志》编辑委员会.中国植物志：第42卷〔M〕.北京：科学出版社，2004.

〔2〕中国科学院昆明植物研究所.云南植物志：第10卷〔M〕.北京：科学出版社，2006.

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〔4〕XIAO C J，ZHANG Y，QIU L，etal.A new schistosomicidal and antioxidative phenylpropanoid from Astragalus engleri⁃anus〔J〕.J Asian Nat Prod Res，2015，17（7）：772-777.

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〔14〕TSUJIHARA K，HONGU M，SAITO K，et al.Na（+）-glu⁃cose cotransporter inhibitors as antidiabetics.I.Synthesis and pharmacological properties of 4'-dehydroxyphlorizin derivatives based on a new concept〔J〕.Chem Pharm Bull，1996，44（6）：1174-1180.

Study on the Compoundswithα-Glucosidase Inhibitory Activity from Roots of Astragalus englerianus

Qiu Lin1,2,Xiao Chaojiang1,2,Dong Xiang1,2,Jiang Bei1,2*
（1.Institute of Materia Medica of DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry, Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the chemical components of Astragalus englerianus,and to explore the active compounds ofαglucosidase's inhibiting from the roots of Astragalus englerianus.Methods:The compounds were isolated and purified by Rp-18, Sephadex LH-20 and silica gel column chromatography.Their structures were identified by modern spectroscopy techniques. Theα-glucosidase's inhibiting experiment was performed by using enzyme inhibitor screening model with 4-nitrophenolα-D-glucopyranoside（PNPG）as the substrate.Results:Six compounds were isolated from ethyl acetate fraction of methanol extract of the roots of A.englerianus and identified as 1-O-hexadecanolenin（1）,2,4'-dihydroxy-4-methoxy dihydrochalcone（2）, daucosterol（3）,5α,6β-dihydroxy-daucosterol（4）,（3R）-vestitol-7-O-glucoside（5）,and（2S,3S,4R,8E）-2-［（2'R）-2-hydroxytetracosanoylamino］-1,3,4-octadecanetriol-8-ene（6）.All of these compounds were examined for theirα-glucosidase inhibitory activities.As a result,compound 2 showed significantly activity with the lower IC50than the positive control,acarbose. Compound 5 and its aglucon,（3R）-vestitol also showed some inhibitory activity.Conclusion:Allofthe compounds were isolated from the roots of A.englerianus for the first time,and the flavonoids showed the betterα-glucosidase inhibitory activity than the other compounds.

Astragalus englerianus;root;compounds;α-glucosidase;inhibitory activity

R932

A

2096-2266（2017）04-0001-05

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.001

（责任编辑 李 杨）

国家自然科学基金资助项目（31170313）

2016-08-16

2016-12-23

邱琳，硕士研究生，主要从事天然产物研究.

*通信作者：姜北，教授，博士.