非损伤微测技术及其应用

宋雪皎 李 岩 张春庆

(作物生物学国家重点实验室，山东农业大学农学院，泰安 271018)

非损伤微测技术及其应用

宋雪皎 李 岩*张春庆*

(作物生物学国家重点实验室，山东农业大学农学院，泰安 271018)

非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique，NMT)是用来测量和研究生命体外微环境中离子/分子流的一种技术。该技术利用选择性电极，在不接触被测样品的情况下，即在保证被测样品完整性和近似实际生理环境状态下，对进出样品的各种离子/分子流进行三维、实时、动态的测量，从而获得离子/分子流的浓度、流速和运动方向信息，是生理和分子机理研究的有力工具。本文就NMT技术的原理、特点、应用领域等方面进行了较为详细的综述。

非损伤微测技术 跨膜流动 离子/分子流

非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique，NMT)起源于美国海洋生物学实验室，由神经科学家Jaffe发明，1990年正式问世，是用来测量和研究生命体外微环境中离子/分子流的一种技术。该技术涵盖包括扫描离子选择性电极技术(Scanning Ion-selective Electrode Technique，SIET)、微电极离子流技术(Microelectrode ion flux estimation technique，MIFE)等在内的多种微电极技术。该技术依托由计算机以及显微成像、屏蔽防震、信号采集、视频转换和精密运动控制等设备组成的一整套NMT系统来实现，并以其特有的时间和空间高分辨率，可以更加全面、直接和方便地获取离子/分子流信息，对现有的电生理技术(如膜片钳技术)做出了重要补充，是鉴定或验证某些生物膜运输系统功能的有力工具。

1 NMT技术原理

1.1 测试原理

NMT技术以Fick第一扩散定律为基础，通过前端灌充液体离子交换剂(liquid ion exchanger, LIX)的离子选择性电极和极谱分子电极分别实现待测离子和分子的选择性测定。图1以测量进出根尖的Cd2+为例来说明NMT技术测试原理[1，2]。选择性电极在待测Cd2+浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量，获得电压V1和V2。两点间的浓度差dc可通过V1和V2和已知的该电极的电压浓度校正曲线和Nernst方程计算获得，将它们带入Fick第一扩散定律公式J0=-D(dc/dx) (其中，D为扩散常数)可计算获得Cd2+跨膜流动的速度和方向。

1.2 电学工作原理

NMT技术通过测定进出样品离子/分子产生的电压值/电流值，从而获得两点间的浓度差dc。因此电学原理是整个NMT系统的工作基础。选择性电极进行检测时，检测信号首先输入到前置放大器，经由信号处理器到达数据采集系统，由微测软件iFluxes进行数据的记录、显示和处理，且可以多通道显示和分析记录的数据；同时，测量过程中iFluxes软件通过数据采集系统与显微成像装置连接，可在测试过程中对被测材料和离子/分子选择电极进行实时图像的捕捉和监控(图1)；另外，测量过程中iFluxes软件与运动控制器连接，运动控制器与位移传递架上的驱动器连接，通过驱动器实现对离子/分子选择电极的三维运动控制(图2)。

图1 NMT技术原理(以测量进出根尖的Cd2+为例)[2]

图2 NMT系统工作流程

2 NMT技术特点

NMT技术的特色与优势详见表1。首先，NMT技术保证了生物样品的完整性和生理活性。NMT技术通过计算机控制选择性微电极，在近似被测样品实际生理条件的液体环境中，在其周围进行三维运动测量，对样品组织或细胞内部生理活动未造成任何干扰和破坏。其次，NMT技术具有较高的时间、空间分辨率及测量灵敏度，其对离子和分子的空间分辨率分别可达0.5μm和2μm，可准确测量离子/分子在特定位点上的运动方向、速率大小以及浓度；可在0.3s检测到一个样品的信号，系统软件可在3.5～5s记录一个数值。另外，该技术可测量同一离子/分子进出生物样品的多个部位，也可同时测量多种离子和分子。Xu等应用NMT技术同时测量麝香百合(Lilium longiflorum)花粉管周围的H+和O2流速，明确了在花粉管生长过程中二者关系[3]。

当然，该技术也存在不足，实际应用中发现离子选择性电极和极谱分子电极的校正较难。此外，离子选择性微电极在测试过程中极易发生电极尖端LIX泄露、尖端留有气泡、尖端损坏等异常情况，一旦发生，都需要重新制作微电极。

3 NMT技术的应用

经过二十多年的发展，NMT技术已被广泛应用于植物学、动物医学、微生物学和环境科学等众多领域的基础性研究，应用情况见表2。

表1 NMT技术的特色与优势

续上表2

在生态环境领域， Xu等利用NMT技术测定了龙葵(Solanum nigrum)和水茄(Solanum torvum)根部对重金属Cd2+的吸收，为探索植物对重金属的耐受性、超富集特性及保持体内平衡的分子机制提供了基础[24]。Sun等应用NMT技术测量耐盐和敏感型白杨品种根部及原生质体上的H+、Na+和Cl-的流量，揭示了生长在高盐渍化土壤中白杨的耐盐机理[25]。Sanchez等发现在微量有机污染物作用下，鱼类胚胎的O2内流速度发生显著变化，可通过检测鱼胚胎O2内流速度判断有机物污染情况，实现对水体环境的监测预警[26]。

4 结束语

NMT技术以生物活体材料跨膜流动的离子/分子流速为测定指标进行生理功能研究，应用领域越来越广泛，如在神经元细胞研究、药物筛选和药效评价以及肿瘤、癌细胞等疾病个体化治疗的动物、医学领域，在绿色农业高产节肥作物选育的农业生产领域、在突发环境灾害预警的生态环境保护领域，在能够极大提高人民生活质量的水安全、食品安全和空气安全等民生领域都将具有广阔的应用前景。

NMT技术以其非损伤性、高时间和空间分辨率等特有的技术优势和提供最直观、最实时、最真实数据的测量特点，可与膜片钳技术、激光共聚焦技术、显微注射技术、活体成像等技术的相结合，在细胞内外生物信息传导方面将具有重要的应用。此外，随着功能基因组学的迅猛发展，基因功能的研究由对单一基因的研究转向大规模、批量分析， NMT技术在重要基因功能研究方面也必将得到广泛应用。

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Non-invasive micro-test technique and its application.

Song Xuejiao, Li Yan*, Zhang Chunqing*

(State Key Laboratory of Crop Biology, College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

Non-invasive micro-test technique (NMT) is a technique which is used to measure the flux of ions or molecules in the micro-environment outside of the life body. This technique uses selective electrode to measure the influx and efflux of ions or molecules without touching the samples in three-dimensions, real time and dynamic way, and the concentration, flow velocity and directions of ions or molecules are acquired. This technique is a powerful tool in studying physiological and molecular mechanism. This paper summarizes the principles, characteristics and application fields of NMT.

non-invasive micro-test technique; transmembrane flow; ion/molecular flow

国家自然科学基金项目(编号：31101160、31271808);山东省博士后创新项目专项资金(编号：201102038)

宋雪皎，女，实验师，1977年出生，主要从事作物生理学方面研究，E-mail: xuejiao500@sohu.com。

李岩，副教授，主要从事种子科学与技术方面研究，E-mail: liyan5011@163.com。张春庆，教授，主要从事种子科学与技术方面研究，E-mail: cqzhang@sdau.edu.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.016

2016-10-13