PC12 细胞在缺氧条件下的自噬现象*

胡中慧， 马慧萍， 樊鹏程， 李加恒， 王俊丽， 蒙 萍， 贾正平△

(1. 兰州军区兰州总医院药剂科， 2. 兰州军区联勤部药品仪器检验所， 甘肃 兰州 730050)

PC12 细胞在缺氧条件下的自噬现象*

胡中慧1,2， 马慧萍1， 樊鹏程1， 李加恒2， 王俊丽2， 蒙 萍1， 贾正平1△

(1. 兰州军区兰州总医院药剂科， 2. 兰州军区联勤部药品仪器检验所， 甘肃 兰州 730050)

目的：考察PC12细胞内自噬发生与缺氧时间的关系，探讨自噬对缺氧细胞的影响作用。方法：以PC12细胞为模型，将对数生长期的细胞加入96孔培养板，37℃、 5% CO2培养24 h后，放入0.5% O2、94.5% N2和5% CO2的培养箱缺氧1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h 和48 h，用MTT法检测细胞存活率，透射电镜观察细胞内自噬体，Westen blot法检测自噬相关蛋白(LC3B、 Atg5和Beclin1)的表达，用试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性、活性氧自由基(ROS)和线粒体膜电位(MNP)水平，探究缺氧不同时间自噬对PC12细胞的作用。结果：在缺氧3～12 h， PC12细胞自噬明显增加，自噬相关蛋白(LC3B、 Atg5和Beclin1)表达增加，尤其是缺氧9 h， PC12细胞存活明显增加，表明短时间缺氧自噬对细胞起保护作用，而随着缺氧时间的延长细胞存活明显降低，自噬相关蛋白表达水平减少，细胞LHD和ROS水平明显增加。MMP水平显著下降，细胞凋亡明显增加。结论：在缺氧早期自噬对PC12细胞起保护作用，但缺氧时间较长，超过了细胞自身调节能力导致细胞死亡。

自噬；PC12细胞；缺氧；自噬相关基因

autophagy; PC12 cells; Hypoxia; autophagy-related genes(Atg)

【DOI】 10.12047/j.cjap.5319.2017.016

氧气对所有真核细胞的正常发育、新陈代谢和内环境稳定至关重要。如果机体遭受氧供给不足或用氧障碍，各组织、器官和细胞均可出现缺氧应激，发生许多病理生理变化及相应的临床症状[1]。为了适应生存，机体在组织和细胞水平发生重大调整以适应低氧环境。机体适应缺氧的机制很多，近年来的研究进展表明，在缺氧条件下，自噬已经成为重要调节机制[2，3]。自噬(autophagy) 是通过形成双层膜结构包裹胞质中的大分子物质(如蛋白质、RNA)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)，并转送至溶酶体中降解，释放氨基酸、核苷酸和脂肪酸等大分子物质，实现再循环，为细胞修复和重建提供原料，以满足细胞代谢和细胞器更新需要[4]。自噬对细胞在应激情况下( 如饥饿、缺氧) 的存活、程序性细胞死亡以及细胞内病原体的清除有重要作用。研究表明[5]，细胞自噬过多或过少等异常现象会严重影响细胞和生物个体的生长、发育和衰老过程，可引发肿瘤、自身免疫性疾病、心血管病、神经系统疾病等多种人类重大疾病。自噬是进化过程中保守行为之一，酵母、哺乳动物都可以找到参与自噬的同源基因，现己统一命名为自噬相关基因 (autophagy-related gene，Atg)[6]。其中Atg5、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin1)等自噬蛋白的定位、修饰及相互作用决定着自噬体的形成、加工、成熟与溶酶体的融合以及再生等动态过程[7]。

大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化细胞株(pheochromocytoma，PC12)是公认的对氧敏感的细胞,已被广泛用于研究神经系统疾病及细胞应对环境氧含量的变化的信号传导机制的一个模型系统[8]。本研究通过实验观察在缺氧条件下，PC12细胞内发生的自噬现象，探讨自噬对缺氧细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖培养基、胎牛血清和马血清(均为兰州民海生物有限公司)；青霉素(哈药制药集团，批号：A120805410)；硫酸链霉素(华北制药股份有限公司，批号：1205103)；鼠神经生长因子(武汉海特生物制药股份有限公司，批号20121265)；甲基噻唑蓝四氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、25%戊二醛和ECL超敏发光液(均为Sigma公司)；LDH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；活性氧ROS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(江苏碧云天生物技术研究所)； RIPA裂解缓冲液(07B13A05)和BCA蛋白检测试剂盒(AR0116)(均为BOSTER)；Anti-LC3B兔多克隆抗体(ab48394)和 Anti-Beclin 1 (ab137355)(均为abcam)；Anti-Atg5(Cell Singnaling Technology)；辣根标记山羊抗小鼠IgG抗体和辣根标记山羊抗兔IgG抗体(均为中杉金桥)。

1.1 细胞培养和缺氧处理

PC12细胞株(购于上海中科院细胞库)加入含10%马血清和5%的胎牛血清及50 ng/ml鼠神经生长因子的DMEM高糖培养基中培养，DMEM高糖培养基中加入100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，2.6 mg/ml碳酸氢钠。PC12细胞培养于面积60 mm的聚苯乙烯培养皿中，置37℃、95% 空气和5% CO2常氧培养箱中孵育，待细胞覆盖80% 左右传代，按每2天1∶3传代，待传代3～4次后，用于实验。

PC12细胞缺氧处理：PC12细胞置37℃、95% 空气和5% CO2培养箱中孵育，至细胞覆盖培养皿80%左右，放入95% N2和5% CO2缺氧培养箱，根据实验的具体要求来设定缺氧时间，缺氧的环境条件除了氧气浓度设置为0.5%之外，其他的外部条件都与常氧培养环境条件保持一致

1.2 细胞存活分析法

通过MTT 法检测在缺氧条件下对PC12细胞存活率的影响。取对数生长期的细胞，加入96孔板，37℃、5% CO2培养24 h后，置缺氧箱中分别缺氧1、3、6、9、12、24、36和48 h。在缺氧时间到达后，每孔中加入MTT溶液，继续置常氧培养箱中培养4 h后，弃去上清液，每个孔中加入DMSO，振摇15 min，经多功能酶标仪于490 nm测量OD值，光密度用来表示细胞的存活率，另设以正常氧培养为对照组(正常生长的细胞+培养基)。

1.3 透射电镜观察自噬

PC12细胞经常氧和缺氧处理后，PBS洗涤、离心、收集细胞，采用戊二醛固定细胞，4℃过夜；用PBS漂洗；然后用 1%锇酸固定液4℃固定，再用PBS漂洗；细胞脱水，把脱水后的细胞包埋在树脂中，固化细胞；固定好的蜡块经超模切片机切片，用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜观察、照相。

1.4 LDH测定

PC12细胞经常氧和缺氧处理后，吸取上清液50 μl，其他按照LDH检测试剂盒说明书操作步骤加相应反应液，混匀，室温放置3 min，用紫外分光光度计于440 nm测定各吸收值。每个缺氧时间点设3个复孔，重复3次取平均值。

1.5 ROS测定

PC12细胞经常氧和缺氧处理后，弃去上清液，加用不含血清的培养基(DMEM)稀释DCFH-DA的工作液1 ml，37℃培养箱中孵育30 min，弃去上清，洗涤两次，PBS吹打均匀，用多功能酶标仪测量各吸收值。ROS供氢体为阳性对照。

1.6 细胞膜电位(MMP)测定

取常氧和缺氧处理后的PC12，按照JC-1检测试剂盒说明书操作步骤加相应JC-1染色工作液，37℃孵育20 min后，洗涤两次，加入150 μl PBS，用多功能酶标仪测量各红绿荧光的吸收值，计算红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。CCCP(10 μmol/L)作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。重复测量3次，取平均值。

1.7 Western blot实验

PC12细胞经常氧和缺氧处理后，用无菌预冷的PBS溶液

清洗，向其加入RIPA裂解液，冰上裂解，收集裂解液，离心，收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定各样品所对应的蛋白浓度。取30 μg蛋白在12%SDS-PAGE上进行电泳，再转至PVDF膜上，用脱脂奶粉的TBST溶液封闭后，于一抗中孵育， 4℃过夜，再把PVDF膜放入二抗溶液中，在室温下孵育后， TBST清洗，使用ECL对PVDF膜进行显色发光处理，利用Tanon-4200SF全自动数码凝胶图像分析系统，对其进行曝光处理。测定灰度值时，使用Image-Pro Plus 6.0软件进行相关数据的分析。每个缺氧时间点重复3次，取平均值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 缺氧对PC12细胞的影响

用MTT法测得常氧下和缺氧下PC12细胞的存活率，在缺氧6 h时细胞存活率为0.73±0.09，而常氧下为0.68±0.08；在缺氧9 h时细胞存活率为0.77±0.06，而常氧下为0.75±0.10；在缺氧12 h时细胞存活率为0.70±0.09，而常氧下为0.78±0.08，细胞存活率明显降低,具有统计学差异(P<0.05)。缺氧48 h后细胞存活率仅为0.49±0.06，细胞存活率显著降低 (P<0.01)，结果表明细胞随着缺氧时间延长存活率明显下降(表1)。

GroupOD值NormoxiaHypoxia1h0.60±0.080.61±0.083h0.61±0.110.63±0.146h0.68±0.080.73±0.099h0.75±0.100.77±0.0612h0.78±0.080.70±0.09*24h0.73±0.090.61±0.09**36h0.76±0.090.54±0.05**48h0.78±0.100.49±0.06**

*P<0.05,**P<0.01vsthe normoxic group

2.2 缺氧诱导PC12细胞自噬现象

透射电镜观察发现随着缺氧时间延长，细胞质内出现自噬泡，有些自噬泡中包裹着线粒体。在缺氧3～12 h自噬明显增加，而缺氧48 h，细胞内出现大量的空泡，出现空泡样或凋亡样细胞死亡(图1)。

2.3 缺氧条件下PC12细胞自噬相关蛋白表达

自噬相关蛋白LC3[9]、Atg5[10]和Beclin1[5,6]参与自噬泡伸展、扩张和形成，并在各种刺激诱导自噬起至关重要作用。通过Western blot实验结果显示LC3B和Atg5水平在缺氧1～24 h明显增加(P<0.01)，36 h后开始下降。Beclin 1在缺氧1～6 h逐渐增加，在缺氧12～24 h明显增加(P<0.05)，36 h后开始下降；而缺氧48 h显著下降(P<0.01)，结果表明细胞随着缺氧时间延长LC3、Atg5和Beclin1出现先增加再下降的趋势(图2，表2)。

Fig. 1 Representative electron microphototographs of autophagy in hypoxia (×8 000) A： Cells in normoxia. cellular, nuclear, endoplasmic reticulum and mitochondria morphology were normal, no autophagosomes; B～I: Cells in hypoxia for 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48 h, respectively

Fig. 2 Representative Western blot images of the LC3, Atg5, Beclin 1 and β-actin protein levels in PC 12 cells for various hypoxic duration

GroupIATargetprotein:IAβ-actinLC3-II/LC3-IAtg5Beclin100.77±0.170.04±0.011.62±0.131h1.10±0.20**0.23±0.02**1.78±0.153h1.59±0.14**0.94±0.08**1.66±0.156h3.09±0.31**0.95±0.07**1.90±0.149h3.46±0.37**1.26±0.09**1.86±0.1412h3.10±0.26**1.25±0.15**2.16±0.27*24h2.17±0.17**1.16±0.09**2.00±0.17*36h1.18±0.11*1.01±0.07**1.75±0.1248h1.02±0.050.03±0.010.32±0.03**

*P<0.05,**P<0.01vs0 h group

2.4 不同缺氧时间下LDH、ROS和MMP指标的考察结果

结果表明常氧下PC12细胞LDH为480.02±16.02 U/L，缺氧1～12 h，LDH降低，在缺氧9 h降至385.01±9.98 U/L，而缺氧36 h后LDH升高至523.58±10.20 U/L，与常氧组相比，显著增加(P<0.05)；而ROS水平在缺氧1～9 h升高缓慢，而缺氧12 h后 ROS水平显著增加(P<0.01)，在缺氧条件下，MMP下降(P<0.01)，随着缺氧时间延长，MMP呈时间依赖性关系(表3)。

GroupLDH(U/L)ROSMMP0h480.02±16.0211.19±1.225.98±0.661h454.83±8.0822.03±1.34**4.77±0.46**3h446.65±18.0122.65±1.57**4.55±0.57**6h404.99±10.89**19.35±0.91**4.24±0.61**9h385.01±9.98**19.76±1.61**2.78±0.49**12h390.09±15.15**67.37±7.43**2.18±0.44**24h476.96±8.1457.80±5.29**1.50±0.39**36h523.58±10.20*34.34±2.32**1.14±0.19**48h510.57±7.66*41.38±6.27**1.19±0.11**

*P<0.05,**P<0.01vsthe 0 h group

3 讨论

缺氧广泛存在于多种病理生理环境中，严重影响细胞的正常功能。机体适应缺氧的机制研究很多，越来越多文献报道，自噬对缺氧细胞起保护作用。缺氧诱导的自噬不仅减少呼吸链中氧气不足产生的自由电子，同时也会使细胞通过分解代谢产生ATP利于细胞在低氧环境下生存[11]。Zhang[12]等人研究表明，缺氧似乎是一个早期促生存的过程，可能作为对细胞预测极端应激的报警信号。也有文献报道耗竭自噬相关蛋白Atg5、Beclin1和LC3其中之一，会增加低氧下细胞死亡[13]。本研究结果显示在不同缺氧时间自噬对PC12细胞的存活率有明显影响，在缺氧早期细胞内自噬泡增多，自噬相关蛋白LC3B、 Atg5和Beclin 1表达增加，自噬现象明显，细胞存活率也明显增加。尽管自噬分子机制和生物功上有了新进展，但在缺氧条件下自噬的作用主要是促进细胞存活还是死亡仍有争议。有文献报道自噬是一种不同于凋亡或坏死的细胞死亡形式[14]。本实验结果也表明长时间缺氧，LC3B、 Atg5和Beclin 1表达减少，自噬现象减弱，推测长时间缺氧对细胞的损伤超过细胞自我修复能力时，会出现大量空泡样死亡细胞。

近年来研究进展表明，缺氧诱导的自噬可通过清除受损的线粒体，调控线粒体更新和循环利用，减少ROS产生，维持细胞内氧化还原的稳态，保护细胞在低氧环境下生存[14,15]。LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，细胞培养液中的LDH大小可反应细胞的损伤程度。MMP是维持正常线粒体的膜结构和功能不可缺少条件，耗损 MMP会产生线粒体碎片。线粒体是ROS生成的主要场所，也最易受ROS危害，受损线粒体会生成更多的ROS，从而出现氧化损伤的恶性循环。因此，及时有效清除受损线粒体对减轻细胞氧化损伤至关重要。通过透射电镜实验结果显示在缺氧早期，PC12细胞内出现大量的自噬泡，其内清晰可见包裹着线粒体，同时ROS水平升高缓慢，LDH增加趋势和MMP下降趋势相对减弱，而缺氧12 h后 ROS和LDH水平显著增加，推测自噬在缺氧一定时间范围内可清除受损线粒体，减少ROS的产生，缓解线粒体膜电位的下降来维持线粒体的功能，维持细胞内环境的稳定，保护PC12细胞在低氧环境下存活，但缺氧时间长对自噬作用反而促进细胞凋亡。本实验中只是观察了缺氧条件下，对PC12细胞自噬发生的表象，但如何调控自噬在防治缺氧策略中更有利还需进一步研究。

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2015-06-08

2016-05-10

Q255

A

1000-6834(2017)01-065-04

△【通讯作者】Tel: 13893616926; E-mail: mahuipingcxr @ aliyun.com