肠淋巴液引流对失血性休克小鼠心肌组织ACE/ACE2的作用*

王紫监， 刘俊芬， 蒋丽娜， 张立民， 刘桂青， 王淮淮， 赵自刚△， 牛春雨△

(1. 河北北方学院微循环研究所， 张家口 075000； 2. 河北北方学院附属第二医院， 宣化 075100； 3. 河北北方学院附属第一医院， 张家口 075000)

肠淋巴液引流对失血性休克小鼠心肌组织ACE/ACE2的作用*

王紫监1,2， 刘俊芬1,3， 蒋丽娜1， 张立民1， 刘桂青1， 王淮淮1， 赵自刚1△， 牛春雨1△

(1. 河北北方学院微循环研究所， 张家口 075000； 2. 河北北方学院附属第二医院， 宣化 075100； 3. 河北北方学院附属第一医院， 张家口 075000)

目的：观察失血性休克后小鼠心肌组织血管紧张素转换酶(ACE)/ACE2平衡的变化及肠淋巴液引流(PHSML)的作用。方法：BALB/c雄性小鼠24只，随机分为对照组、假手术组、休克组、休克+引流组(n=6)。建立失血性休克模型，行液体复苏；休克+引流组液体复苏后，引流肠淋巴液。在液体复苏后6 h或假手术组相应时间点、对照组于麻醉后，留取心肌组织，qRT-PCR法检测ACE、ACE2、血管紧张素II(Ang II)1型受体(AT1R)、Mas相关G蛋白偶联受体(Mas1R)的mRNA表达，ELISA方法检测Ang II和Ang (1-7)含量。结果：休克组小鼠心肌组织ACE与AT1R mRNA表达、Ang II水平均显著高于对照组与假手术组，ACE2与Mas1R mRNA表达显著低于对照组与假手术组、Ang (1-7)含量显著低于对照组，ACE/ACE2、Ang II/Ang (1-7)、AT1R/Mas1R显著高于对照组与假手术组；PHSML引流显著抑制了失血性休克对这些指标的作用。结论：失血性休克上调心肌ACE-Ang II-AT1R轴、下调ACE2-Ang (1-7)-Mas1R轴表达，引起ACE/ACE2失衡；PHSML引流下调ACE-Ang II-AT1R轴、上调ACE2-Ang (1-7)-Mas1R轴表达，在一定程度上维持了ACE/ACE2平衡。

失血性休克；肠淋巴液；引流术；心肌；血管紧张素转换酶；小鼠

【DOI】 10.12407/j.cjap.5397.2017.015

失血性休克引起的心肌损伤是心肌收缩功能障碍、微循环障碍、多器官损伤导致休克难治甚至死亡的结构基础[1, 2]。研究表明，失血性休克后肠淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph，PHSML)回流是加重心肌结构损伤、心泵功能障碍的重要因素[3-5]。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system，RAS)广泛存在于与循环系统相关的血管、心肌组织中，与肾性高血压、冠心病等心血管疾病的发生机制相关[6, 7]；此外还与失血性休克后的微循环障碍、组织低灌注密切相关[8]；血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)-血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)-Ang II-1型受体(Ang II 1 receptor，AT1R)与ACE2- Ang (1-7)- Mas相关G蛋白偶联受体(Mas related G protein coupled receptor, MasR1)是RAS的两条关键轴，ACE/ACE2失衡参与了止血带性休克肾、肺损伤的发生[9, 10]；但二者在失血性休克后心肌损伤中的作用如何？PHSML引流减轻心肌损伤的作用是否与调节ACE/ACE2平衡有关，值得研究。为此，本研究观察PHSML引流对失血性休克小鼠心肌组织ACE、ACE2、AT1R、Mas1R mRNA表达以及Ang II和Ang (1-7)含量的影响，探讨PHSML对失血性休克小鼠心肌组织ACE/ACE2平衡的作用，进一步揭示肠淋巴途径在失血性休克后心肌损伤发病学中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

24只健康、清洁级BALB/c雄性小鼠，购于中国军事医学科学院实验动物中心(实验动物许可证号SCXK(军) 2007-004)，体重为20～28 g。适应性饲养后用于本实验。根据动物实验要求，实验前所有动物需禁食12 h，并给予自由饮水。实验过程中动物处置的方法依据实验动物伦理学标准执行。所有小鼠在麻醉后，随机均分为：对照组(Control)、假手术组(Sham)、休克组(Shock)、休克+引流组(Shock+ drainage)(n=6)。

1.2 手术操作方法

按照本研究室常规方法建立小鼠失血性休克模型[11]，即：经右侧股动脉放血使平均动脉血压至40 mmHg，维持在(40±2)mmHg水平60 min；经左侧股动脉行液体复苏(放出的全血+等量林格氏液)，30 min完成；输液结束后再观察平均动脉血压6 h。休克+引流组在输液结束后，行肠淋巴液引流；假手术组仅进行与休克组、休克+引流组相同的手术，但不放血、不输液、不引流淋巴液，观察至与休克组、休克+引流组相同的时间点；对照组麻醉后直接取材。

1.3 标本留取

上述实验程序结束后，即休克组、休克+引流组在输液结束后6 h、假手术组在与休克组相同时间点、对照组在麻醉后，留取心肌组织，分为两部分存于EP管中，保存于-80℃低温冰箱中。其中，部分用于制备组织匀浆，应用ELISA方法检测Ang II和Ang (1-7)的含量；部分用于提取RNA，应用qRT-PCR方法检测肾组织ACE、ACE2、AT1R、Mas1R的mRNA表达。

1.4 qRT-PCR分析

取冷冻的心肌组织，应用Trizol试剂(碧云天生物技术研究所)常规方法提取总RNA；总RNA浓度经紫外分光光度计(Lambda 35，PE)检测合格后，应用FastQuant cDNA第1链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)常规方法逆转录反应合成cDNA，进行PCR扩增(StepOnePlus型实时荧光定量PCR仪，ABI)。引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列及产物分别为：ACE：正义5’AGCACGACCCTTTACTGGTT3’，反义5’TCACCTGGGCTGTTAGGAAG3’，118 bp；ACE2：正义5’GGCTTCTGCCTTCACACTTC3’ ，反义5’CTGGCTTCTTTCTCCGTTGA 3’，100 bp；AT1R：正义5’AACTGCTGGTGTGCCCTACT3’ ，反义5’AACAGGCCATCTCACTG GTC3’，101 bp；Mas1R：正义5’CCTGGCAAAGGCAGGATCTA3’ ，反义5’TTCAGCAAAAC TCGGCAAGC3’，161 bp；GAPDH作为内参(产品号PMM04)。反应条件：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min；循环次数依次为：38、39、40、38。每份标本进行3次技术重复，取均值，纳入结果分析。

1.5 ELISA分析

取冷冻的心肌组织，常规方法制备10%组织匀浆；应用ELISA试剂盒检测Ang II、Ang (1-7) 水平(抗体由美国R&D公司生产、试剂盒由江苏镇江厚普生物科技有限公司合成)；标准曲线：Ang II为y=0.006x-0.000033x2+0.000000116x3(R2=0.9946)，Ang (1-7)为：y=0.005x+0.0000373x2-0.00000015x3(R2=0.9960)；应用BCA蛋白定量检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)检测各组织匀浆的蛋白浓度，用于Ang II和Ang (1-7)的标准化。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 肠淋巴液引流对失血性休克小鼠心肌组织ACE/ACE2平衡的作用

休克组小鼠心肌组织ACE mRNA表达显著高于、ACE2 mRNA表达显著低于对照组与假手术组(P<0.05)；肠淋巴液引流降低了失血性休克小鼠心肌组织ACE mRNA表达、提高了ACE2 mRNA表达水平，但仍分别高于或低于对照组与假手术组(P<0.05)。休克组小鼠心肌组织ACE/ACE2比值显著高于对照组与假手术组(P<0.05)；肠淋巴液引流显著降低了ACE/ACE2比值，但仍高于对照组与假手术组(P<0.05)。假手术组ACE2 mRNA表达水平显著低于、ACE/ACE2比值显著高于对照组(P<0.05，表1)。

GroupACEmRNA(ACE/GAPDH)ACE2mRNA(ACE2/GAPDH)ACE/ACE2Control0.847±0.0392.254±0.4120.38±0.05Sham1.063±0.0580.596±0.059*1.80±0.08*Shock2.377±0.295*#0.046±0.006*#51.82±7.50*#Shock+drainage1.362±0.213*#△0.360±0.042*#△3.82±0.41*#△

ACE: Angiotensin converting enzyme

*P<0.05vscontrol group;##P<0.05vssham group;#△P<0.05vsshock group

2.2 肠淋巴液引流对失血性休克小鼠心肌组织Ang II和Ang (1-7)水平的影响

失血性休克小鼠心肌组织Ang II含量显著高于对照组与假手术组、Ang (1-7)含量显著低于对照组(P<0.05)；肠淋巴液引流显著降低了休克小鼠心肌组织Ang II含量、提高了Ang (1-7)含量(P<0.05)，与对照组与假手术组均无统计学差异。此外，失血性休克小鼠心肌组织Ang II/Ang (1-7)比值显著高于对照组与假手术组(P<0.05)；肠淋巴液引流显著降低了休克小鼠心肌组织Ang II/Ang (1-7)比值(P<0.05)，与对照组和假手术组无统计学差异(表2)。

2.3 肠淋巴液引流对失血性休克小鼠心肌组织AT1R和Mas1R mRNA表达的影响

与对照组与假手术组比较，失血性休克引起小鼠心肌组织AT1R mRNA、Mas1R mRNA、AT1R/Mas1R差异有显著性(P<0.05)；肠淋巴液引流降低了休克小鼠心肌组织AT1R mRNA表达水平、提高了Mas1R mRNA表达水平、降低了AT1R/Mas1R比值，与对照组与假手术组比较，差异有显著性(P<0.05)。此外，假手术组Mas1R mRNA表达水平显著低于、AT1R/Mas1R 比值显著高于对照组(P<0.05，表3)。

GroupAngII(ng/g·protein)Ang(1-7)(ng/g·protein)AngII/Ang(1-7)Control7.95±1.457.17±1.201.11±0.33Sham7.87±1.736.99±1.611.17±0.35Shock2.87±2.71*#5.09±0.27*2.54±0.59*#Shock+drainage9.10±1.83△6.91±0.54△1.31±0.19△

Ang: Angiotensin

*P<0.05vscontrol group;##P<0.05vssham group;#△P<0.05vsshock group

GroupAT1RmRNA(AT1R/GAPDH)Mas1RmRNA(Mas1R/GAPDH)AT1R/Mas1RControl0.316±0.0061.435±0.0410.221±0.004Sham0.406±0.0200.592±0.114*0.704±0.132*Shock2.454±0.259*#0.068±0.010*#36.940±8.171*#Shock+drainage0.835±0.036*#△0.271±0.014*#△3.092±0.211*#△

AT1R: Angiotensin II 1 receptor; Mas1R: Mas related G protein coupled receptor

*P<0.05vscontrol group;##P<0.05vssham group;#△P<0.05vsshock group

3 讨论

失血性休克后，交感-肾上腺髓质轴兴奋，引起RAS活化，生成Ang II增多，Ang II与其受体AT1R结合后发挥缩血管效应，这对于恢复回心血量、保证重要器官心、脑的血液供应具有重要作用。但长期、持续的ACE-Ang II-AT1R轴活化，除了加重局部器官缺血外，也会引起心肌组织血管收缩引起缺血。研究发现，ACE-Ang II-AT1R轴在止血带性休克后的肺、肾组织出现了表达上调，参与肺、肾组织损伤的病理过程[9, 10]；但在失血性休克后心肌损伤的过程中，ACE-Ang II-AT1R轴有何变化，尚不清楚。研究发现，失血性休克引起了小鼠心肌组织ACE、AT1R的mRNA表达与Ang II水平均显著升高，而PHSML引流显著降低了休克小鼠心肌组织的ACE、AT1R的mRNA表达与Ang II水平。研究结果表明，过度活化的ACE-Ang II-AT1R与休克后的心肌损伤有关，而PHSML引流减轻心肌损伤的作用是通过抑制ACE-Ang II-AT1R过度活化实现的。

ACE2作为ACE的同源物，通过催化Ang II转化成Ang (1-7)、进一步与MasR结合发挥扩张血管作用，在血压调节中具有重要作用[12-14]。鉴于ACE2-Ang (1-7)-Mas1R轴对血管收缩的负性调节作用，本研究观察了失血性休克小鼠心肌组织ACE2-Ang (1-7)-Mas1R轴的变化及PHSML引流的作用。结果发现，失血性休克显著降低了小鼠心肌组织ACE2、Mas1R mRNA表达与Ang (1-7)含量，PHSML引流提高了休克小鼠心肌组织ACE2、Mas1R mRNA表达水平以及Ang (1-7)含量。这说明ACE2-Ang (1-7)-Mas1R轴受抑制可能与休克后的心肌损伤有关，可以考虑为，由于Ang (1-7)的含量降低，血管舒张功能下降，回心血量减少，加重心肌缺血，从而导致心肌缺血性损伤；而PHSML引流减轻心肌损伤的作用是通过增加ACE2-Ang (1-7)-Mas1R表达实现的，最为可能的是通过减少对ACE-Ang II-AT1R轴的刺激，从而提高了ACE2轴的活性。

ACE2-Ang (1-7)-MasR具有拮抗ACE-Ang II-AT1R的作用，RAS的稳定离不开ACE-Ang II-AT1R、ACE2-Ang (1-7)-MasR的平衡[15]。本文结果发现，失血性休克引起了小鼠心肌组织ACE/ACE2、Ang II/Ang (1-7)、AT1R/Mas1R显著升高，且这种作用可以被PHSML引流有效地逆转。结果表明，失血性休克状态下的PHSML回流参加了ACE/ACE2失衡的形成过程，调节二者平衡是PHSML引流发挥保护作用的机制之一。同时，结果也发现，PHSML引流组小鼠心肌组织的ACE、AT1R mRNA表达仍高于对照组与假手术组，ACE2、Mas1R mRNA表达仍低于正常对照组与假手术组，这也说明，在失血性休克后，PHSML引流这一手段并没有完全将ACE-Ang II-AT1R、ACE2-Ang (1-7)- Mas1R的平衡恢复正常。这些结果表明，失血性休克引起心肌组织ACE-Ang II-AT1R上调、ACE2-Ang (1-7)- Mas1R下调的因素除了PHSML回流的作用外，还有其它因素参与。当然，这有待在今后的研究中进一步关注。此外，研究也发现，行假手术的小鼠心肌组织ACE2、Mas1R mRNA表达较对照组显著降低、ACE/ACE2、AT1R/Mas1R显著升高；究其原因，可能是由于手术创伤的因素刺激实验动物引起的。

总的来说，失血性休克引起了心肌组织ACE-Ang II-AT1R轴上调、ACE2-Ang (1-7)-MasR轴下调，导致ACE/ACE2失衡；PHSML引流恢复了失血性休克小鼠心肌组织ACE/ACE2轴的平衡。研究结果也提示，探讨减少PHSML回流的治疗措施、关注改善ACE/ACE2平衡的治疗手段，有利于防治失血性休克后的心肌损伤。此外，减少PHSML回流有利于改善失血性休克后的心肌收缩功能[3, 4]，那么，改善RAS平衡是否参与了心肌收缩功能的调节，这还有待于今后观察RAS主要成分相关工具药是否能够恢复失血性休克后的心肌收缩功能。

[1] Soliman MM, Arafah MM. Treatment with dipyridamole improves cardiac function and prevent injury in a rat model of hemorrhage [J].EurJPharmacol, 2012, 678(1-3): 26-31.

[2] Chatpun S, Cabrales P. Cardiac systolic function recovery after hemorrhage determines survivability during shock [J].JTrauma, 2011, 70(4): 787-793.

[3] Sambol JT, Lee MA, Caputo FJ,etal. Mesenteric lymph duct ligation prevents trauma/hemorrhage shock-induced cardiac contractile dysfunction [J].JApplPhysiol(1985), 2009, 106(1): 57-65.

[4] Sambol JT, Lee MA, Jiang M,etal. Mesenteric lymph from rats with trauma-hemorrhagic shock causes abnormal cardiac myocyte function and induces myocardial contractile dysfunction [J].JApplPhysiol(1985), 2011, 111(3): 799-807.

[5] 赵自刚, 牛春雨, 陈瑞华, 等. 肠淋巴途径对休克大鼠心肌自由基、炎性介质的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2007, 23(4): 385-389.

[6] 赵金晶, 李春华, 冯旭辉, 等. 清醒高血压大鼠心率变异分析的动物模型建立[J].中国应用生理学杂志, 2006, 22(1): 62-63.

[7] 孙玉发, 曹 剑, 李晓利, 等. 多基因SNP位点及多种危险因素与老年汉族冠心病的关联分析[J]. 中国应用生理学杂志, 2012, 28(5): 411-417.

[8] Schumacher J, Puchakayala MR, Binkowski K,etal. Effects of candesartan and enalaprilat on the organ-specific microvascular permeability during haemorrhagic shock in rats [J].BrJAnaesth, 2006, 96(4): 437-443.

[9] Yang XH, Wang YH, Wang JJ,etal. Role of angiotensin-converting enzyme (ACE and ACE2) imbalance on tourniquet-induced remote kidney injury in a mouse hindlimb ischemia-reperfusion model [J].Peptides, 2012, 36(1): 60-70.

[10]Chen LN, Yang XH, Nissen DH,etal. Dysregulated renin-angiotensin system contributes to acute lung injury caused by hind-limb ischemia-reperfusion in mice [J].Shock, 2013, 40(5): 420-429.

[11]刘俊芬, 蒋丽娜, 张立民, 等. 失血性休克小鼠肠淋巴液引流恢复肾组织ACE/ACE2平衡的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(11): 2096-2100.

[12]Fernandes L, Fortes ZB, Nigro D,etal. Potentiation of bradykinin by angiotensin-(1-7) on arterioles of spontaneously hypertensive rats studied in vivo [J].Hypertension, 2001, 37: 703-709.

[13]Ferrario CM. Angiotensin-converting enzyme 2 and angiotensin-(1-7): an evolving story in cardiovascular regulation [J].Hypertension, 2006, 47(3): 515-521.

[14]Xue B, Zhang Z, Johnson RF,etal. Central endogenous angiotensin-(1-7) protects against aldosterone/NaCl-induced hypertension in female rats [J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol, 2013, 305(5): H699-705.

[15]Ingelfinger JR. ACE2: a new target for prevention of diabetic nephropathy [J].JAmSocNephrol, 2006, 17(11): 2957-2959.

Role of mesenteric lymph drainage in the balance of ACE/ACE2 in murine myocardium following hemorrhagic shock

WANG Zi-jian1,2, LIU Jun-fen1,3, JIANG Li-na1, ZHANG Li-min1, LIU Gui-qing1, WANG Huai-huai1, ZHAO Zi-gang1△, NIU Chun-yu1△

(1. Institute of Microcirculation of Hebei North University, Zhangjiakou 075000; 2. the Second Affiliated Hospital of Hebei North University, Xuanhua 075100; the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

Objective: To observe the change of angiotensin converting enzyme (ACE) and ACE2 in the murine myocardium followed hemorrhagic shock and the role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) drainage. Methods: Twenty-four male mice were randomly divided into control, sham, shock, and shock+drainage groups. A hemorrhagic shock model was established and then fluid resuscitation was performed to the mice in the shock and shock+drainage groups, and the PHMSL was drained in the shock+drainage group after fluid resuscitation. After 6 h of resuscitation in the shock and shock+drainage groups or corresponding time in the sham group, or after anesthesia in the control group, the myocardial tissues were harvested for the determination of the mRNA expressions of ACE, ACE2, angiotensin II (Ang II) type 1 receptor (AT1R), and Mas related G protein coupled receptor (Mas1R) using the method of qRT-PCR, and the levels of Ang II and Ang (1-7) using the method of ELISA. Results: In the myocardial tissue of shock group, the ACE and AT1R mRNA expressions and Ang II level were significantly increased than those of the control and sham groups, the ACE2 and Mas1R mRNA expressions were significantly decreased than that of the control and sham groups, the Ang (1-7) level was decreased compared with the control group, the ratios of ACE/ACE2, Ang II/Ang (1-7), and AT1R/Mas1R in the shock group were significantly increased than the control and sham groups. Meanwhile, PHSML drainage obviously suppressed the effects of hemorrhagic shock on these indices. Conclusion: Hemorrhagic shock up-regulated the ACE-Ang II-AT1R axis, down-regulated the ACE2-Ang (1-7)-Mas1R axis, and induced the unbalance of ACE and ACE2 in myocardial tissue. PHSML drainage decreased the ACE-Ang II-AT1R axis and increased the ACE2-Ang (1-7)-Mas1R axis, resulted in the balance of ACE and ACE2.

hemorrhagic shock; mesenteric lymph; drainage; myocardium; angiotensin converting enzyme; mouse

河北北方学院创新人才培育基金(CXRC1314)

2015-12-14 【修回日期】2016-10-17

R364.1；R331.4

A

1000-6834(2017)01-061-05

△【通讯作者】Tel： 0313-4029223， 0313-4029168； E-mail： zzghyl@126.com， ncylxf@126.com