注射异丙肾上腺素建立大鼠心肌肥厚模型

赵美眯，李卓，杨艳，张翀翯，陈思充，曾晓荣，郝丽英

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110122；2.西南医科大学心血管医学研究所医学电生理学教育部重点实验室，四川省心血管疾病防治协同创新中心，四川泸州646000）

注射异丙肾上腺素建立大鼠心肌肥厚模型

赵美眯1，李卓1，杨艳2，张翀翯1，陈思充1，曾晓荣2，郝丽英1

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110122；2.西南医科大学心血管医学研究所医学电生理学教育部重点实验室，四川省心血管疾病防治协同创新中心，四川泸州646000）

目的采用异丙肾上腺素诱导心肌肥厚，建立大鼠模型，并研究该动物模型的基本特性。方法大鼠背部皮下注射剂量为5 mg/kg的异丙肾上腺素，每日1次，连续注射14 d。结果模型组大鼠的全心重/体质量，左心室重/体质量均明显增加。模型组大鼠血清中羟脯氨酸（HYP）含量显著增加。模型组大鼠心肌组织中总超氧化物歧化酶（SOD）含量与对照组相比显著降低，而丙二醛（MDA）含量明显升高。结论皮下注射异丙肾上腺素14 d，可成功诱导大鼠心肌肥厚模型，为深入研究心肌肥厚的确切机制奠定基础。

心肌肥厚；异丙肾上腺素；动物模型

异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）是β受体激动剂，通过激活动物肾上腺素促进多种信号转导通路，刺激心肌细胞内相关DNA的合成以及蛋白的表达，引起胶原沉积、心肌纤维化，最终出现心肌肥厚［1-2］。目前，注射ISO建立心肌肥厚动物模型的方法虽然很常用，但是其药物剂量和给药时间并不统一。本研究根据文献资料及预实验结果，拟选择大鼠皮下注射ISO建立心肌肥厚模型，模拟心肌肥厚的实际病理生理过程，为后续研究心肌肥厚的发病机制和治疗方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SD大鼠，体质量180～220 g，雌性、雄性各12只，由中国医科大学动物部提供。

1.1.2 主要药品与试剂盒：ISO购自TCI公司，货号为I0260。肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒，羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）试剂盒，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒，以及丙二醛（malondialdehvde，MDA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为A032，A030-2，A001-1，A003-1。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌肥厚造模：将24只SD大鼠随机分成对照组和模型组，每组12只，雌雄各半。2组大鼠背部分别皮下注射0.9%NaCl和ISO，剂量为5 mg/kg，每日1次，连续注射14 d，自由进食水。ISO配制成2.5mg/mL的溶液，现用现配。注射剂量为0.2mL/100 g体质量［8］。

1.2.2 心肌肥厚模型的指标检测：造模第15天，大鼠称重后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定。首先，开腹进行腹主动脉取血。具体操作为打开腹腔，用镊子将腹腔脏器翻转一侧后，拨开脊柱前脂肪和筋膜，暴露腹主动脉；采血针穿刺腹主动脉见回血后，另一端插入BD真空管，取大约5 mL全血，室温静置。3 000 r/min，10 min，4℃离心后，取上层血清大鼠放入2 mL EP管中，用于CK与HYP测定。然后打开胸腔，暴露心脏，剪开肺动脉放心腔内血，用0.9%NaCl从主动脉冲洗心脏之后，将心脏完整取下。将心脏洗净后肉眼观察心脏大小，并拍照，称重。计算心肌肥厚指数，包括全心重（mg）/体质量（g）（heart weight/body weight，HW/BW）和左心室重（mg）/体质量（g）（left ventricular weight/body weight，LHW/BW）。取左心室上部浸泡于4%多聚甲醛溶液中保存，用于组织切片HE染色。取左心室中部，-80℃保存，用于制成心肌组织匀浆，进行SOD与MDA的测定。

CK、HYP、SOD和MDA的检测按照试剂盒的说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 模型大鼠的体质量和心肌肥厚指数水平

连续注射ISO 14 d后，与雌性、雄性对照组分别比较，模型组大鼠的HW/BW分别为（5.65±0.23）mg/g和（4.68±0.06）mg/g（P＜0.01），LHW/BW分别为4.05±0.15和3.44±0.08（P＜0.01），均明显增加，见表1。其中，雌性和雄性模型组大鼠HW/BW分别是对照组的1.65倍和1.45倍，LVW/BW分别是对照的1.56倍和1.45倍。雌性模型组大鼠心脏增加的倍数与雄性组无统计学差异，提示ISO诱导心肌肥厚在雌性和雄性SD大鼠均可造模成功。

2.2 模型大鼠的心肌细胞形态学表现

连续注射ISO 14 d后，模型组大鼠心脏体积明显增大。HE切片染色显示对照组心肌细胞正常，细胞之间排列整齐；模型组心肌纤维粗大紊乱，心肌细胞横断面的直径增大，细胞核变形，间质增宽，出现纤维化，偶见淤血，见图1。

表1 模型大鼠的体质量和心肌肥厚指数水平Tab.1Body weight and cardiac hypertrophy index in model rats

2.3 模型大鼠的血清中CK和HYP水平

ISO诱导的模型组大鼠的血清中CK活力，与对照组相比无统计学差异（图2A）。模型组和对照组大鼠的血清中HYP含量分别为（22.22±0.64）μg/mL和（19.77±0.59）μg/mL，模型组含量明显增加（P＜0.05，图2B）。

2.4 模型大鼠的心肌组织中SOD和MDA含量

模型组大鼠的心肌组织中SOD活力为（111.25± 2.91）U/mg，对照组SOD活力为（170.32±21.05）U/ mg，模型组明显降低（P＜0.05，图3A）。大鼠心肌组织中模型组（n=3）和对照组（n=3）MDA含量分别为（0.87±0.03）mol/mg和（0.47±0.09）mol/mg，模型组有明显增加（P＜0.05，图3B）。

3 讨论

心肌肥厚早期因心室壁增厚、心肌收缩力增强而被视为代偿性过程，但是在病理性刺激长久持续的情况下，心肌肥厚伴随心肌纤维化的发生，心肌收缩功能失调，能量代谢异常，电生理功能紊乱，最终出现失代偿性的心力衰竭［3-5］。本研究采用ISO诱发的心肌肥厚模型很好地模拟了这一失代偿过程，观察到心脏体积的增大、心肌细胞的肥大、心肌组织的纤维化和氧化代谢异常等。

图1 心肌肥厚模型大鼠的心肌组织HE染色×40Fig.1Hematoxylin-eosin staining of myocardial tissue in rats with myocardial hypertrophy×40

图2 心肌肥厚模型大鼠的血清中CK和HYP水平Fig.2Serum CK and HYP levels in rats with myocardial hypertrophy

图3 心肌肥厚模型大鼠的心肌组织中SOD和MDA含量Fig.3Levels of SOD and MDA in rats with myocardial hypertrophy

HYP在氧化剂的作用下，二甲氨基苯甲醛与HYP产生的氧化产物作用出现紫红色，根据紫红色的深浅利用比色法可计算出HYP的含量。结果显示模型组大鼠的血清HYP含量显著增加。心肌纤维化时，主要增加的成分是胶原纤维，HYP为胶原纤维所特有［6］，因此，模型大鼠HYP的增加提示该模型大鼠心肌肥厚时，间质纤维增生，心脏纤维化。SOD在体内氧化与抗氧化动态平衡中有很重要的作用，超氧阴离子自由基可被此酶消除，防止细胞受到损伤。超氧阴离子自由基是在黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统中产生的，它可氧化羟胺生成亚硝酸盐，并在显色剂的作用下出现紫红色，可测出其吸光度。若被测样品中存在SOD时，可专一性抑制超氧阴离子自由基，使亚硝酸盐的生成减少，此时测得的测定管吸光度值比对照管的吸光度值低，SOD活力即可通过公示算出。MDA是过氧化脂质降解的产物，硫代巴比妥酸可与其反应，随即生成红色产物，利用比色法可推算出MDA含量。模型组心肌组织中总SOD含量降低、MDA含量的明显增加，反映了心肌细胞清除氧自由基的能力有所下降，受自由基攻击的严重程度升高，脂质过氧化程度加重，心肌损伤［7］。

以上研究结果证实，大鼠背部皮下注射ISO（5 mg/kg）2周，成功达到心肌肥厚的指标。心肌组织的纤维化和氧化代谢异常与钙离子信号通路密切相关，将设计后续实验利用该动物模型深入研究钙离子信号通路在心肌肥厚发生发展中的作用及其机制，拟从新的视角探讨心肌肥厚的作用机理。此外，该模型简单易行，重复性好，经济可靠，也适合于开展新药的药效学研究。

［1］CHOWDHURY D，TANGUTUR AD，KHATUA TN，et al.A proteomic view of isoproterenol induced cardiac hypertrophy：prohibitin identified as a potential biomarker in rats［J］.J Transl Med， 2013，11：130.DOI：10.1186/1479-5876-11-130.

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［3］SHIMIZU I，MINAMINO T.Physiological and pathological cardiac hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，2016，97：245-262.DOI：10.1016/j.yjmcc.2016.06.001.

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（编辑 于溪）

Rat Model of Isoproterenol-induced Cardiac Hypertrophy

ZHAO Meimi1，LI Zhuo1，YANG Yan2，ZHANG Chonghe1，CHEN Sichong1，ZENG Xiaorong2，HAO Liying1
（1.Department of Drug Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang，110122，China；2.Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education，Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease，Institute of Cardiovascular Research，Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）

ObjectiveTo establish a rat model of cardiac hypertrophy induced by isoproterenol（ISO），and to study its basic characteristics.MethodsCardiac hypertrophy was induced in rats with ISO.The model rats received subcutaneous injections of 5 mg/kg ISO every day for 14 days.ResultsThe heart weight/body weight and left ventricular weight/body weight ratios in model rats were significantly increased.The serum hydroxyproline level was significantly increased，the superoxide dismutase level was significantly decreased，and the malondialdehyde level was significantly increased in model rats.ConclusionThe rat model of cardiac hypertrophy is successfully created by subcutaneous injection of ISO for 14 days.This model can be used in study of the mechanism of cardiac hypertrophy.

cardiac hypertrophy；isoproterenol；animal model

R96

A

0258-4646（2017）05-0406-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.006

国家自然科学基金（31500930，31471091）；医学电生理学重点实验室开放基金（KeyME-2014-03）

赵美眯（1978-），女，讲师，博士.

曾晓荣，E-mail：zengxiaorong8818@163.com

2016-08-31

网络出版时间：