柠檬酸的乳酸菌发酵降解途径及其应用

袁星星，余元善，徐玉娟，*

（1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东广州510610）

柠檬酸的乳酸菌发酵降解途径及其应用

袁星星1，2，余元善2，徐玉娟2，*

（1.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东广州510610）

青梅、柠檬和柑橘等高酸水果中含大量柠檬酸，用这些原料制成果酒果汁，其降酸技术一直是食品行业的研究热点及难点。本文阐述了乳酸菌发酵降解柠檬酸的代谢途径及其关键酶，并对乳酸菌可利用柠檬酸作为碳源进行生长作可行性分析。同时也综述了乳酸菌发酵在果汁果酒降酸中的应用研究进展。最后，分析乳酸菌降解柠檬酸的优缺点并对其在食品工业上的应用进行展望。

乳酸菌；柠檬酸；降酸；代谢途径；发酵

乳酸菌在食品发酵中扮演着重要角色，如酸奶、奶酪、啤酒、泡菜等，其主要特征是可以将糖类物质转化成乳酸，另外，研究也发现，部分乳酸菌还可代谢柠檬酸等非糖物质[1-3]，这一发现为乳酸菌发酵在食品工业中的应用提供了新的思路。柠檬、柑橘、菠萝、山楂等果实含有大量柠檬酸，用这些原料制成果酒果汁，其降酸技术一直是食品行业的研究热点。目前，国内外主要采用物理降酸、化学降酸和生物降酸[4]，达到降低食品总可滴定酸的目的。其中物理降酸又称低温冷冻降酸，主要原理是随着温度的降低，酒体中的酒石酸及其盐类结晶沉淀。该法的优点是不引入其他物质，操作简便，尤其适于冬季生产。缺点是仅能降低酒石酸盐的含量且降酸幅度较小，不适于其它有机酸去除[5]，应用对象比较有限，常用于酸度较高的葡萄酒生产。蒋志东等[6]对葡萄酒进行冷冻处理，发现降低温度可以使酒石酸钙和酒石酸氢钾呈过饱和状态，引起酒石沉淀，但不能引起苹果酸盐沉淀。化学降酸法主要有中和法（向果汁体系加入碱或碱式盐）、离子交换树脂和电渗析法等，但化学降酸很容易导致酒体不稳定或酒体风味损失[7]。Vera等[8]指出，CaCO3用于果汁降酸会产生CO2，生成气泡，影响果汁质量。生物降酸是利用微生物的生长代谢分解有机酸，从而达到降酸的目的，微生物降酸不仅能使总酸下降，而且能改进果汁果酒体系的的风味，成为现代降酸主要的研究和发展方向[9]。目前，应用微生物发酵降解苹果酸的技术较为成熟，其代谢机制主要为苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）和苹果酸－酒精发酵（malo－alcohol fermentation，MAF）。MLF是由明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）、足球菌属（Pediococci）和片球菌属（Pediococcus）等乳酸菌引起的二次发酵[10]，主要机理是L－苹果酸在乳酸菌（Lactic acid bacteria）的苹果酸－乳酸酶（malolactic enzyme，MLE）及Mn2+的催化下转变成L－乳酸和CO2的过程[4，11]。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）主要进行MAF途径，其生理活性依靠的是苹果酸通透酶（mae1）和苹果酸酶（mae2）的作用[12]，能正常利用糖作底物生成酒精，其次还能在厌氧条件下分解苹果酸，最终生成乙醇和CO2[4]。

乳酸菌对柠檬酸的发酵降解作用最早在奶油成熟过程中被发现。研究表明，乳酸菌能代谢柠檬酸生成奶油风味的双乙酰，明显改善奶油产品的风味[13－14]。目前，对于乳酸菌代谢柠檬酸相关代谢途径的研究已较成熟。本文概括了乳酸菌降解柠檬酸的代谢途径及其关键酶，并对乳酸菌以柠檬酸作为碳源作可行性分析，同时，分析其优缺点并展望可降解柠檬酸的乳酸菌在果汁果酒降酸中的应用前景。

1 乳酸菌降解柠檬酸的代谢途径及其关键酶

乳酸菌对柠檬酸的发酵代谢途径较复杂，发酵菌株和培养条件等多种因素决定了其代谢途径的差异。与乳酸菌发酵代谢柠檬酸相关的代谢途径和关键酶主要概括如下：

柠檬酸转运酶在柠檬酸代谢中扮演着重要角色，其功能是将柠檬酸从细胞外转运到细胞内[15]。该酶由菌株的质粒编码，如果菌株中不存在编码柠檬酸转运酶的质粒，则不发生柠檬酸代谢。研究发现该酶具有较窄的pH值耐受性，如David[16]发现乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的柠檬酸转运酶在pH为5.0～6.0时酶活性较高，这与Starrenburg等[17]和Smith等[18]的发现一致。当pH低于5.0时，由于这些微生物的柠檬酸转运酶活性较低，因此柠檬酸利用率较低。

1.2 柠檬酸裂解酶（Citrate lyase）

柠檬酸裂解酶是乳酸菌发酵柠檬酸的关键酶，在不发酵柠檬酸的乳酸菌中未发现该酶的存在[20]，该酶的功能是催化柠檬酸和辅酶A生成乙酰辅酶A和草酰乙酸[21]，终产物为乙酸和草酰乙酸。研究发现，当体系中存在柠檬酸时，柠檬酸裂解酶的活性相比于不存在柠檬酸时活性高，而与体系pH值无关[22]。

1.3 草酰乙酸脱羧酶（Oxaloacetate decarboxylase）

由柠檬酸分解生成的草酰乙酸在草酰乙酸脱羧酶的作用下转化为丙酮酸、二氧化碳。与柠檬酸转运酶和柠檬酸裂解酶不同，一些不代谢柠檬酸的菌株可能也含有草酰乙酸脱羧酶。

1.4 与丙酮酸代谢相关的酶及其代谢途径

丙酮酸是乳酸菌柠檬酸发酵代谢途径中的关键中间产物，受菌株类型和培养环境的影响，其代谢途径主要有4种，如图1所示，各代谢途径相关的关键酶如下：

图1 丙酮酸的代谢途径Fig.1 Metabolism pathways of pyruvate

1.4.1 乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）

乳酸脱氢酶以NADH和丙酮酸为底物，反应生成乳酸和NAD+[23]，其中NADH是乳酸脱氢酶代谢途径的必要条件，柠檬酸与糖联合发酵产生NADH，为细胞提供必要的生物还原力。

观察组患者导管留置时间、护理满意度均高于对照组，组间比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

乳酸脱氢酶分为L－乳酸脱氢酶和D－乳酸脱氢酶。L－乳酸脱氢酶主要受到由果糖－1，6－二磷酸调节。当果糖－1，6－二磷酸含量低时，乳酸脱氢酶的活力也降低。因此，当培养条件中糖类物质含量较低时，乳酸脱氢酶的活力也较低[17，24－25]。D－乳酸脱氢酶存在于大量异型发酵乳酸菌中，包括明串珠菌属[26]，该酶不同于L－乳酸脱氢酶，其酶活不受其他物质调节；若D－乳酸脱氢酶存在于可利用柠檬酸的微生物中，则在任何情况下，柠檬酸均转化为乳酸[17，27－28]。在利用乳酸菌发酵降解果汁中有机酸时，为了避免过多的乳酸产生，我们需要通过诱变育种或代谢工程改造等方式控制菌株的乳酸脱氢酶活性，避免生成大量的乳酸。

1.4.2 丙酮酸甲酸裂解酶（Pyruvate formate lyase，PFL）

丙酮酸甲酸裂解酶能催化丙酮酸生成乙酰磷酸和甲酸。乙酰磷酸在乙酸激酶的作用下（底物水平磷酸化）生成乙酸和ATP，形成混酸发酵[29]。

丙酮酸甲酸裂解酶主要存在于（兼性）厌氧菌中。该酶对氧气较敏感，氧气充足时该酶的活力较低。另外，pH值是影响PFL活性的另一个因素，混酸发酵通常发生在中性条件下，当pH低于6时没有甲酸产生，这与Takahashi等[30]报道的变形链球菌（Streptococcus mutans）在pH为7.5时PFL活性最高的结果相符。因此在氧气不足且pH值为中性时，丙酮酸甲酸裂解酶活性较高，发生丙酮酸甲酸裂解酶代谢途径的可能性较大。在果汁果酒乳酸菌发酵降酸体系中，体系的pH一般在3.5以下，丙酮酸甲酸裂解酶的活性可能较低。Yu等[1]研究青梅经发酵乳杆菌发酵降酸后的产物中也没有检测到甲酸的生成，这进一步说明丙酮酸甲酸裂解酶途径难以在果汁果酒的柠檬酸降酸体系表现出较高的代谢活性。

1.4.3 丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate dehydrogenase complex，PDC）

丙酮酸脱氢酶复合体广泛存在于微生物、植物和动物体中，其催化丙酮酸脱氢酶代谢途径将丙酮酸转化成高能量的乙酰辅酶A、CO2和NADH[31]，生成的乙酰辅酶A通过乙酸激酶反应（底物水平磷酸化）生成乙酸和ATP，因此乳酸菌通过该途径可以为菌株的生长提供必要的能量和生物还原力（NADH）。

该酶复合体由3种不同的酶组成，这3种酶分别为丙酮酸脱氢酶（E1）、硫辛酸乙酰转移酶（E2）和二氢二硫辛酸脱氢酶（E3）。E1催化丙酮酸脱羧，E2催化辅酶因子的再生，E3催化氧化反应。该酶催化的丙酮酸脱氢酶代谢途径通常在氧气充足的条件下发生，在厌氧环境且NADH在细胞质中含量较高时，PDC活性较低。

1.4.4 a－乙酰乳酸聚合酶（a－Acetolactate synthase，ALS）

a－乙酰乳酸聚合酶代谢途径由a－乙酰乳酸聚合酶以丙酮酸为底物催化两个丙酮酸反应生成a－乙酰乳酸[20]。首先焦磷酸盐作为辅酶，1个丙酮酸分子脱羧，形成羟乙基－TPP（活性乙醛），然后活性乙醛与另一分子丙酮酸结合形成a－乙酰乳酸。通常情况下，微生物不会发生该途径，Hugenholtz[20]指出丙酮酸在细胞内积累时才产生乙酰乳酸，由其他3种丙酮酸途径可知，当代谢丙酮酸的酶（LDH、PFL、PDC）被抑制时，细胞内积累了大量的丙酮酸，才可能发生a－乙酰乳酸聚合酶代谢途径。在氧气充足、pH较低且丙酮酸盐溶液中仅有a－乙酰乳酸聚合酶时，a－乙酰乳酸进一步化学脱羧生成具有奶油气味的双乙酰[17，29]，因此该方法常应用于工业生产奶油和人造黄油。在低pH且不存在发酵糖的条件下，a－乙酰乳酸在乙酰乳酸脱羧酶的催化下生成乙偶姻，乙偶姻可作为终产物被排出或在乙偶姻还原酶的催化下生成丁二醇。在利用乳酸菌发酵降酸体系中，为了避免生成的双乙酰影响果汁的原有风味，我们也需要通过代谢工程手段控制a－乙酰乳酸聚合酶的活力，尽量避免双乙酰的过量产生。

2 乳酸菌以柠檬酸为碳源和能源的可行性分析

研究发现某些乳酸菌生长过程中能以柠檬酸作为唯一碳源[17，32]，也就是说在没有发酵糖的存在下，乳酸菌可以利用柠檬酸代谢产生的ATP和生物还原力（NADH）进行生长。通过对以上4种乳酸菌代谢柠檬酸（或丙酮酸）的代谢途径分析可以发现，丙酮酸脱氢酶途径可以产生大量的生物还原力（NADH），而丙酮酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶途径可以通过底物水平磷酸化的方式产生ATP。另外，一些研究也表明，柠檬酸裂解酶分解柠檬酸过程中可能通过底物水平磷酸化的方式产生ATP[20，26]。总之，已有大量研究发现，乳酸菌可以利用柠檬酸作为碳源进行生长，详细的代谢途径和可能的关键酶还需要通过更深入的研究进行发掘。

3 微生物发酵降解柠檬酸在果汁果酒降酸中的应用研究

天然的柠檬酸主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、山楂等植物果实中，尤其是柑橘属的柠檬和青柠含有大量的柠檬酸，干燥后含量可达8%，果汁中的含量大约为47 g/L，含量远远高于正常人可接受的口感酸度。目前食品工业中大多采用稀释降酸法降低柠檬酸，但通过稀释降酸法配制的食品不但口感差而且降低保健效果。利用微生物降解柠檬酸的研究较少，赵玉平等[33]在柠檬酸生产污水中筛选出一株既能有效降解山楂汁柠檬酸又对山楂黄酮影响较小的酵母菌——毕赤酵母属，定名为Pichia sp.Y1，通过对其进行降酸特性研究，结果表明Pichia sp.Y1优先降解柠檬酸，当柠檬酸降解到一定浓度后开始降解苹果酸。王立芳等[34]从葡萄园土壤中分离得到一株既能降解L－苹果酸又能降解柠檬酸的菌株，经鉴定为伊萨酵母属（Issatchenkia）陆生伊萨酵母种（I.terricola）（Genbank登录号为HM355830），对其进行降酸能力实验，结果表明L－苹果酸和柠檬酸浓度在4 g/L～12 g/L范围内，该菌株对L－苹果酸和柠檬酸的降解能力相差不大；在12 g/L时，对L－苹果酸和柠檬酸的降解率达到最大，分别为93.17%和92.08%；当超过12 g/L时，菌株对L－苹果酸的降解能力变化不大，但对柠檬酸的降解能力明显减弱，说明当柠檬酸质量浓度大于12 g/L时，已不利于降解柠檬酸的酶发挥作用。文连奎等[35]在王立芳等[34]的基础上，利用筛选的陆生伊萨酵母对L－苹果酸和柠檬酸进行降解，考察菌株对SO2、酒精度、pH值的耐受性，发现陆生伊萨酵母可耐受450 mg/L的SO2、5%（体积分数）的酒精、最低pH值为2的酸度，且对质量浓度为8 g/L～20 g/L的L－苹果酸和质量浓度为8 g/L～12 g/L柠檬酸降解率均达90%以上。由以上可知，一般可以降解柠檬酸的菌株同时具有降解苹果酸的能力，这与Ferdinand等[36]结论一致。

在乳酸菌发酵降解柠檬酸方面，虽然国外科研人员一个多世纪以前便发现了代谢柠檬酸的乳酸菌，但对其研究倾向于柠檬酸的代谢机制，除了将其应用在乳制品工业中增加双乙酰生成，提高产品风味外，并没有广泛应用。如Aline[37]发现葡萄酒中的柠檬酸能被异型发酵的球杆菌（明串珠菌属和酒球菌属）或兼性异型发酵的乳杆菌（植物乳杆菌和干酪乳杆菌）所降解。Torino等[38]研究瑞士乳杆菌ATCC 15807柠檬酸代谢，发现在pH为4.5～6.2时该菌能同时代谢柠檬酸和乳糖，并且与未加柠檬酸相比，添加柠檬酸后增加了乳糖代谢速率，提高了乳酸产量；而且添加柠檬酸后，该菌由纯乳酸发酵变为混酸发酵，但乳酸仍然是主要的代谢终产物。2014年，Laëtitia等[39]发现乳酸菌代谢柠檬酸的过程中产生质子动力（proton motive force，PMF），PMF在短时间内能使乳酸菌抵抗能量匮乏的环境，因此可代谢柠檬酸的乳酸菌在含柠檬酸的体系中为优势菌，特别是恶劣的生长环境。Magni等[40]也发现可代谢柠檬酸的乳酸菌更能耐受乳酸毒性。以上研究为乳酸菌能够降解柠檬酸提供理论依据，并为后续的研究提供新的思路。近几年，课题组在乳酸菌发酵降解柠檬酸的应用研究方面取得了些重要突破。我们从水果中筛选了一株能有效降解柠檬酸和苹果酸的发酵乳杆菌（Lactobacillus Fermentium），该菌株能在不消耗（或仅少量消耗）果汁中糖的情况下优先利用柠檬酸和苹果酸，仅产生少量的乳酸和CO2，因此能将培养液中可滴定酸含量降低50%左右[2]。该菌株对乙醇具有较高的耐受性，当培养液中乙醇浓度达到9%（体积分数）以上时，菌株的生长和柠檬酸代谢受到明显的抑制；该菌株对亚硫酸盐非常敏感，培养液中仅仅添加0.5 mmol/L的亚硫酸钠后，菌株的生长和柠檬酸代谢将会被完全抑制。培养液中蔗糖的添加能促进菌株的生长和柠檬酸代谢，但在柠檬酸存在的情况下，该菌株对蔗糖的转化利用较弱。同时，我们也评估了该菌对青梅[1]、三花李（主要含苹果酸）和茶枝柑果汁[2]的降酸效果及其品质的变化规律，发现该菌株均能显著降低果汁总滴定酸，明显改善果汁的糖酸比和营养品质，并且也未发现明显的双乙酰风味产生。

4 展望

相比于物理降酸和化学降酸，微生物降酸具有反应条件温和、费用低、简便易行、便于大量生产等优点，而且降酸过程中可能产生风味物质，改善食品品质。特别是乳酸菌发酵降解柠檬酸产生乳酸，不仅可以有效降低果酒果汁等的可滴定酸，使口味更加温和，而且有益于人体肠道健康。其次，乳酸菌降解柠檬酸的过程中可能产生具有奶油风味的双乙酰，明显改善奶油等产品的风味。此外，乳酸菌降解柠檬酸的方法有望代替传统盐腌或糖腌制作含酸量高的果脯，如青梅果脯，改善传统果脯较咸的口感。但乳酸菌发酵柠檬酸在实际应用中可能会存在一些问题。第一，发酵不稳定。由柠檬酸的代谢途径可知，柠檬酸代谢由多种酶调节，在不同的环境下，可能发生不同的代谢途径，因此，对于不同的食品，第一步应该对乳酸菌在食品中的代谢机制进行初步探索，以便控制。第二，应用乳酸菌降解青梅酒的酸度时，较高的乙醇浓度可能会影响乳酸菌活性，因此，能否应用现代生物技术（如基因工程、细胞融合）将乳酸菌降解柠檬酸的基因与酿酒酵母产酒精的基因融合并稳定表达有待进一步探索。

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Citric Acid Fermentation of Lactic Acid Bacteria and Its Application

YUAN Xing-xing1，2，YU Yuan-shan2，XU Yu-juan2，*
（1.College of Food Science&Food Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China；2.Sericultural&Agri-Food Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，Guangdong，China）

Many fruits are rich in citric acid，such as green plum，lemon and citrus，so how to decrease the content of organic acid has been paid attention and exists many difficulties.In this review，the metabolic pathways and key enzymes related to citric acid fermentation with lactic acid bacteria was discussed，and the feasibility of citric acid as sole carbon source for the growth of lactic acid bacteria was evaluated.Moreover，the application of deacidification by lactic acid bacteria in fruit juice or wine was summarized.Finally，analyzed the advantages and disadvantages and prospects the application in food industry.

lactic acid bacteria；citric acid；deacidification；metabolic pathways；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.046

2016－08－23

广东省科技计划项目（2015B0202204001）

袁星星（1992—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通信作者：徐玉娟（1974—），女（汉），研究员，博士，研究方向：农产品深加工。