UPLC-MS/MS同时测定肉汤中5种罂粟壳生物碱

高志莹，洪霞，刘琦，钱滢文，周鑫魁，何海宁

（1.甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃兰州730010）

UPLC-MS/MS同时测定肉汤中5种罂粟壳生物碱

高志莹1，2，洪霞1，2，刘琦1，2，钱滢文1，2，周鑫魁1，2，何海宁1，2

（1.甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃兰州730010）

建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定肉汤中5种罂粟壳生物碱含量的方法。肉汤样品用0.1 mol/L盐酸提取，经ProElut PXC固相萃取柱富集净化后，5%氨水-甲醇溶液洗脱。采用Thermo Hypersil Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）分离，ESI正离子扫描，多反应监测模式采集测定。3个浓度添加水平的回收率在71.8%～112.5%之间，相对标准偏差（RSD）为4.1%～11.0%（n=6）。吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁的检出限分别为1.2、0.8、0.4、0.05、0.04 μg/kg。本方法可用于同时检测肉汤中5种罂粟壳生物碱。

超高效液相色谱-串联质谱法；肉汤；固相萃取；罂粟壳生物碱

罂粟壳为罂粟科植物罂粟的干燥成熟果壳，具有敛肺、涩肠、止痛等功效[1]。同时，它也是一种毒品，其果实中含吗啡（Morphine）、可待因（Codeine）、蒂巴因（Thebaine）、罂粟碱（Papaverine）、那可丁（Noscapine）等20多种生物碱。罂粟壳中的生物碱虽然含量较少，但如果长期食用含有这类毒品的食物，会出现发冷、出虚汗、乏力、面黄肌瘦、犯困等症状，严重时可能对神经系统、消化系统造成损害，甚至出现内分泌失调等症状，严重危害消费者的健康[2]。国家卫生部、工商总局早在2005年就发布了《关于加强罂粟籽食品监督管理工作的通知》，规定罂粟籽仅允许用于榨取食用油脂，不得在市场上销售或用于加工其他调味品[3]。本文针对牛肉拉面肉汤中的5种罂粟壳生物碱进行检测，能够高效、准确的对大批样品进行处理分析。

目前，针对食品中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可丁的检测方法，发布了1项地方标准[4]。文献报道的主要有酶联免疫法[5－6]、薄层色谱法[7－8]、分子生物法[9－10]、示波极谱法[11]、气相色谱法[12－13]、气－质联用法[14－16]、液相色谱法[17－21]、液－质联用法[22－30]、飞行时间质谱法等[31]。其中，酶联免疫法存在交叉反应，特异性较差；气相色谱法和气－质联用法前处理操作步骤复杂；液相色谱法灵敏度较低；飞行时间质谱虽有较高的灵敏度及准确度，但仪器价格昂贵难以普及。超高效液相色谱能极大地提高分析速度，且具有高分辨率、高灵敏度，定性、定量准确，检测限低的特点，成为此类药物检测的主要方法。本试验采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，ESI正离子扫描、多反应监测模式，对肉汤中的吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可丁进行同时测定。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱－串联质谱仪（UltiMate 3000/TSQ Quantum Access MAX）、Hypersil Gold色谱柱（100 mm× 2.1 mm×1.9 μm）：美国Thermo公司；高速冷冻离心机（CF16RXⅡ）：日本Hitachi公司；涡旋混匀器（VORTEX 3）：德国IKA公司；真空离心浓缩仪（miVac）：英国GeneVac公司；超声器（SB－5200DTN）：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平（JJ500）：常熟双杰测试仪器公司；ProElut PXC固相萃取柱（200 mg，6 mL）：迪马科技有限公司。

罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合标准溶液：美国o2si公司。标准储备液：甲醇溶解并稀释，置于－18℃保存，可使用半年。标准工作液：使用前用流动相稀释配制成适合浓度的混合标准工作液。

甲醇、甲酸为色谱纯试剂（Fisher）；试验用水为超纯水；盐酸、氨水为分析纯试剂。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取

准确称取10 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入15 mL 0.1 mol/L的盐酸，涡旋混匀后超声提取10 min，在4℃下以8 000 r/min的速度离心5 min，收集清液于另一50 mL离心管中待净化。若含有油脂，可加入10 mL石油醚，涡旋10 s后离心，弃去有机相，下层清液待净化。

1.2.2 净化

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化固相萃取柱，保持柱体湿润。将全部上清液以约2滴/秒～3滴/秒的流速通过已活化的固相萃取柱，用5 mL甲醇、5 mL水淋洗，弃去全部流出液，在65 kPa负压下减压抽干5 min以上。然后用6 mL甲醇－氨溶液（含体积分数5%氨水的甲醇）洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，于真空离心浓缩仪中浓缩至近干，氮气吹干后用流动相溶解并定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后待测。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm× 1.9 μm）；流速：0.25 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40℃；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱表Table 1 Gradient elution table

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离；扫描方式：ESI正离子扫描；监测模式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：3.5 kV；雾化气温度：200℃；毛细管温度：320℃；鞘气：12 L/min；辅助气：1.5L/min。5种生物碱成分质谱分析参数见表2。

表2 质谱分析参数Table 2 ESI-MS/MS analysis parameters

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 提取条件优化

罂粟碱、可待因、蒂巴因、那可丁为碱性有机毒物，吗啡为两性有机毒物，它们都能与酸作用生成易溶于水的盐。由于肉汤样品中含有多种调味料，成分复杂，而油脂成分不是很多，所以采用酸性水溶液（0.1 mol/L盐酸）混匀及提取样品，将目标化合物溶于水相后用混合型阳离子固相萃取柱富集净化，淋洗除杂后以碱性有机溶剂洗脱，可同时有效提取5种目标化合物，减少杂质的干扰。

2.1.2 净化方式选择

肉汤样品中罂粟壳生物碱的提取和净化方法主要有液液萃取法、QuEChERS法和固相萃取法等。液液萃取是在碱性条件下采用氯仿、乙醚或乙酸乙酯进行萃取，方法操作复杂且试剂为易挥发的有毒有害液体，不适用于大批量样品的净化。本试验考察了用QuEChERS法提取净化5种生物碱的效果。样品经乙腈提取，再经PSA（乙二胺－N－丙基硅烷）填料、无水硫酸镁、C18粉末富集净化后直接测定，该方法操作快捷、简单，但基质干扰物多，净化效果差，回收率低（50%左右）。其次还考察了3种固相萃取柱富集净化5种生物碱的效果。分别为稀盐酸溶液过混合型强阳离子PXC柱、乙酸铵缓冲溶液过混合型弱阳离子PWC柱、弱碱性溶液过亲水亲脂平衡PLS柱。结果表明PXC柱的洗脱回收率（71.8%～112.5%）明显高于PWC柱（45.3%～72.5%）和PLS柱（33.4%～68.2%），因此本试验选用PXC柱作为SPE净化柱。

2.2 仪器分析条件优化

2.2.1 色谱条件

5种罂粟壳生物碱为极性到中等极性化合物，使用Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）色谱柱，0.1%甲酸水－甲醇流动相梯度洗脱，提高了离子化效率，有利于色谱峰的分离及峰形的改善。使5种化合物在5 min内完全分离。

2.2.2 质谱条件

采用蠕动注射泵稳定、连续的注射标准溶液优化质谱条件，确定每种被测组分的母离子，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子作为定性与定量离子。采用ESI源，正离子多反应监测模式最大程度的检测目标离子，使5种生物碱的质谱灵敏度最优。在上述色谱质谱条件下，标准溶液、空白样品和加标样品的总离子流图见图1。从图中可见5种化合物的峰形均较好，未见明显的干扰峰。

图1 标准溶液和样品的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of standard solution and sample

2.3 样品基质效应的消除

用超高效液相色谱-串联质谱法分析样品时，基质效应会影响定量检测的准确性。为消除样品基质效应，可用阴性样品提取液作为稀释液配制标样，可使标样和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除样品的基质效应。试验比较了标准溶液和基质标准溶液的信号响应差别。结果表明：基质效应使吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可丁的信号强度分别降低了约69.3%、63.0%、77.3%、62.2%和68.3%，因此使用基质标准溶液进行定量很有必要。

2.4 线性关系、检出限、定量限、回收率及精密度

2.4.1 线性关系和检出限、定量限

用阴性基质溶液配制吗啡和可待因浓度为5、25、50、100、250、500 μg/L，蒂巴因、罂粟碱和那可丁浓度为1、5、10、20、50、100 μg/L的系列混合标准溶液，分别进样，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。根据检出限含量处的信噪比（RSN）等于3的原则确定5种化合物的检出限，根据定量限含量处的信噪比（RSN）等于10的原则确定5种化合物的定量限。其线性关系和检出限、定量限见表3。

表3 5种化合物的线性分析及检出限、定量限Table 3 Linear analysis，detection limits and of five compounds

2.4.2 回收率和精密度

在10 g阴性样品中添加不同量的混合标准溶液，制得3个水平的标准添加样品，其中吗啡、可待因的添加浓度为0.5、2.5、10.0 μg/kg，蒂巴因、罂粟碱、那可丁的添加浓度为0.1、0.5、2.0 μg/kg，每个水平添加样品做6个平行试验。按本试验方法操作，外标校准曲线法定量。回收率、相对标准偏差见表4。

表4 5种化合物的回收率及精密度试验结果（n=6）Table 4 Recovery rates and precision of five compounds

样品在该添加范围内，回收率在71.8%～112.5%之间，相对标准偏差（RSD）在4.1%～11.0%之间。

3 结论

本文建立了测定肉汤样品中罂粟壳生物碱的超高效液相色谱串联质谱分析方法。在样品净化时采用ProElut PXC固相萃取柱进行富集净化，同时对其他分析参数做了进一步优化，改进了提取和净化效果。分析时采用质谱ESI源正离子扫描、多反应监测模式采集测定，在5 min内可完成5种化合物的完全分离，提高了方法的灵敏度。3个浓度添加水平的回收率为71.8%～112.5%，相对标准偏差（RSD）为4.1%～11.0%（n=6）。吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁的检出限分别为1.2、0.8、0.4、0.05、0.04 μg/kg。方法线性良好，样品的标准添加回收率试验及精密度试验显示方法定量准确，重现性好，可以作为实际样品中罂粟壳生物碱测定的分析方法。

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Determination of 5 Opium Poppy Husk Alkaloids in Broth by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

GAO Zhi-ying1，2，HONG Xia1，2，LIU Qi1，2，QIAN Ying-wen1，2，ZHOU Xin-kui1，2，HE Hai-ning1，2
（1.Gansu Business Technology Institute，Lanzhou 730010，Gansu，China；2.Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.，Ltd.，Lanzhou 730010，Gansu，China）

A method for simultaneous determination of 5 opium poppy husk alkaloids in broth sample was developed by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.Broth samples were extracted by 0.1 mol/L hydrochloric acid，then concentrated and purified by ProElut PXC solid-phase extraction column，after that were eluted by 5%ammonia-methanol.The separation was performed on a Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）column，and detected by mass spectrometry using electrospray ionization（ESI）in positive mode under multiple reaction monitoring mode.The recovery rates of the spiked sample was in the range of 71.8%-112.5%and the relative standard deviation（RSD）was between 4.1%to 11.0%（n=6）.The detection limits for morphine，codeine，thebaine，papaverine and narcotine were 1.2，0.8，0.4，0.05 μg/kg and 0.04 μg/kg.This method can be successfully applied to the simultaneous detection for 5 opium poppy husk alkaloids in broth.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；broth；solid-phase extraction；alkaloid in opium poppy husk

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.028

2016-08-25

甘肃省动物源性制品安全分析与检测技术重点实验室（1309RTSA025）；甘肃省动物源性制品快速检测工程技术研究中心（1009FTGA018）；中-马清真食品国家联合实验室食品检测平台建设（1505JTCA017）

高志莹（1983—），女（汉），工程师，本科，研究方向：食品安全分析与检测。