响应面分析法优化西瓜番茄红素提取工艺条件

李杰，罗建成，李慧星，王莹

（南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004）

响应面分析法优化西瓜番茄红素提取工艺条件

李杰，罗建成，李慧星，王莹

（南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004）

为确定西瓜番茄红素最佳提取工艺条件，综合运用单因素试验、析因试验、最陡爬坡试验及响应面分析试验对西瓜番茄红素提取工艺条件进行了深入研究。结果表明，提取温度和料液比是影响西瓜番茄红素得率的显著性因子，西瓜番茄红素最佳提取工艺条件为：提取温度45℃，料液比1∶18（g/mL），提取时间75 min，提取次数3次。此条件下，西瓜番茄红素得率可达2.7409mg/g。

西瓜番茄红素；提取工艺；响应面

番茄红素（lycopene）是一种脂溶性的类胡萝卜素，主要存在于番茄、西瓜、红色葡萄柚、南瓜、木瓜和粉红色番石榴等常见的水果及蔬菜中[1]。番茄红素有较强的抗氧化性，具有防治肺癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌等作用，还具有提高免疫力、预防心脑血管疾病、延缓衰老等功效，因此番茄红素也被称为“植物黄金”[2-4]；另一方面番茄红素也是集营养与着色双重作用于一身的工业添加剂，广泛应用于食品添加剂、医药和化妆品等领域[5]。响应面法（RSM）是以数学模型为工具，描述响应值与考察因素之间相互关系的一种数据分析处理方法。由于采用科学合理的试验设计，响应面分析法能够以最经济的方式对考察因素进行全面分析和研究，并快速有效地确定多因素系统的最佳条件，广泛应用于生物化工等过程的优化[6-8]。本文在单因素试验、析因试验、最陡爬坡试验的基础上，结合响应面分析法对西瓜番茄红素提取工艺条件进行了深入研究，以期为西瓜中番茄红素的开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 原料

西瓜：购自万德隆超市，去除瓜皮后取瓤、除籽，将除籽后的瓤切成小块，分别置于研钵中研磨，研磨均匀后抽滤除汁，抽滤后的果肉置于洁净的烧杯中，加入适量甲醇避光静置2 h后，进行抽滤脱水，将抽滤脱水后的果肉摊平，置于40℃条件下，烘干备用。

1.2 试剂

乙酸乙酯：无锡市亚太联合化工有限公司；石油醚：南京化学试剂股份有限公司；丙酮、正己烷：国药集团化学试剂有限公司；氯仿：科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇：天津市北辰方正试剂厂，所用试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器及设备

DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；YP10KN电子天平：上海精密科学仪器有限公司；UV7502PC紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；SHZ-82水浴恒温振荡器：常州国华电器有限公司；TGL-16C高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SHB-III型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

2 方法

2.1 西瓜番茄红素提取工艺路线

西瓜果肉粉→丙酮浸提→离心→上清液→过滤→滤液低温干燥→西瓜番茄红素

2.2 最大吸收波长的确定

用电子天平称取2.0 g经预处理的西瓜果肉粉，加入30 mL丙酮，置于45℃恒温水浴锅中震荡浸提60 min，离心机离心，取上清液过滤即得浸提液，将浸提液适当稀释，用分光光度计测定浸提液在不同波长下的吸光度。

2.3 标准曲线的绘制

由于番茄红素标准品价格昂贵，且见光易分解，而苏丹红I与番茄红素有类似的特征吸收峰，故用苏丹红I代替番茄红素标准品绘制标准曲线[9]。精密称取苏丹红I 1.000 0 g（因纯的番茄红素标准品极不稳定，同时其最大吸收波长接近于苏丹红I，且苏丹红I比较稳定，因此可用它来代替番茄红素制作标准曲线），用无水乙醇溶解后，定溶至1 000 mL。用移液管移取不同量的苏丹红I色素溶液，分别配置成浓度为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的标准溶液。在501 nm下测定其吸光度值，绘制标准曲线。

2.4 单因素试验

对西瓜番茄红素得率有影响的因素有提取剂种类、提取温度、料液比、提取时间、提取次数等，分别进行单因素试验以考察其对西瓜番茄红素得率的影响。

2.5 析因试验设计[10]

在单因素试验基础上，选用N＝16的析因试验设计，对提取温度χ1、料液比χ2、提取时间χ3和提取次数χ4进行考察，每个因素取-1和1两个水平，以西瓜番茄红素得率Y测为试验指标，试验设计见表1。

表1 析因试验设计Table 1 The factorial experiment design

2.6 最陡爬坡试验设计[11]

选取对试验指标影响显著的因素χ1和χ2进行最陡爬坡试验，因素χ1和χ2对试验指标有正效应，需增大；因素χ3和χ4对试验指标虽有正效应，但影响不显著，可将χ3和χ4固定在1水平，试验设计见表2。

表2 最陡爬坡试验设计Table 2 The steepest ascent experiment design

2.7 响应面分析试验设计

根据最陡爬坡试验结果，采用Box-Behnken中心组合试验设计原理[12]，对提取温度和料液比进行中心组合试验设计，因子编码值分别为X1、X2（其中X1=（χ1-46）/3，X2=（χ2-19）/3），响应值为西瓜番茄红素得率Y测。试验设计见表3。

表3 响应面分析试验设计Table 3 The response surface experimental design

2.8 西瓜番茄红素得率计算公式

式中：Y测为西瓜番茄红素的得率，mg/g；V为西瓜番茄红素浸提液的体积，mL；C为西瓜番茄红素浸提液稀释后的浓度，μg/mL；N为稀释倍数；M为浸提所用西瓜果肉原料质量，g。

3 结果与讨论

3.1 最大吸收波长的确定

不同波长下西瓜番茄红素浸提液的吸光值见图1。

图1 不同波长下西瓜番茄红素浸提液的吸光值Fig.1 The absorbance of watermelon lycopene leach liquor on different wavelength

由图1可知，西瓜番茄红素浸提液在442、472、501nm各有一个吸收峰，但由于在442nm及472nm时，浸提液中番茄红素的类似物β-胡萝卜素也有较强吸收峰，对测定结果干扰较大，而在501 nm时β-胡萝卜素的吸收很小，可消除对番茄红素测定结果的干扰[13]，故选择501 nm作为西瓜番茄红素提取的检测波长。

3.2 西瓜番茄红素对照品苏丹红I标准曲线的绘制

对照品苏丹红I标准曲线见图2。

图2 对照品苏丹红I标准曲线Fig.2 Standard curve of tony red I reference substance

图2为对西瓜番茄红素对照品苏丹红I标准曲线，线性回归方程为Y=0.083 7X-0.005 4，R=0.999 7。

3.3 单因素试验结果

3.3.1 不同提取剂对西瓜番茄红素得率的影响

不同提取剂对西瓜番茄红素得率的影响见图3。

图3 不同提取剂对西瓜番茄红素得率的影响Fig.3 The effect of different extracting solvent on the yield of watermelon lycopene

由图3可知，使用乙酸乙酯、石油醚、正己烷作为提取剂时，西瓜番茄红素提取效果较好，其次是丙酮、氯仿，用无水乙醇作为提取剂时，提取效果较差。由于使用乙酸乙酯、石油醚、正己烷作为提取剂，在浸提过程中有不同程度的结团现象，使用丙酮作为提取剂未出现结团现象，故选择丙酮作为提取剂。

3.3.2 提取温度对西瓜番茄红素得率的影响

提取温度对西瓜番茄红素得率的影响见图4。

图4 提取温度对西瓜番茄红素得率的影响Fig.4 The effect of extracting temperature on the yield of watermelon lycopene

由图4可知，温度低于40℃时，随着温度升高，分子运动逐渐剧烈，西瓜番茄红素的扩散速率增大，在丙酮中的溶解度增大，西瓜番茄红素得率逐渐增大，但高于40℃时，由于西瓜番茄红素受热不稳定，当温度过高达到55℃时，丙酮挥发很快，损失较大，得率急剧下降。

3.3.3 料液比对西瓜番茄红素得率的影响

料液比对西瓜番茄红素得率的影响见图5。

由图5可知，随料液比增大，可能经预处理的西瓜粉原料在提取剂中分布更均匀，西瓜番茄红素得率逐渐增大，但当提取剂用量大于30 mL后，提取剂对溶质而言，分布空间已足够大，故随提取剂用量增大，对西瓜番茄红素得率影响不大。

图5 料液比对西瓜番茄红素得率的影响Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the yield of watermelon lycopene

3.3.4 提取时间对西瓜番茄红素得率的影响

提取时间对西瓜番茄红素得率的影响见图6。

图6 提取时间对西瓜番茄红素得率的影响Fig.6 The effect of extracting time on the yield of watermelon lycopene

由图6可知，随着提取时间的延长，西瓜番茄红素得率逐渐增大，但高于75 min后，可能西瓜番茄红素提取传质逐渐达到平衡，也可能由于提取时间过长，提取剂挥发，西瓜番茄红素得率降低。

3.3.5 提取次数对西瓜番茄红素得率的影响

提取次数对西瓜番茄红素得率的影响见图7。

图7 提取次数对西瓜番茄红素得率的影响Fig.7 The effect of extracting times on the yield of watermelon lycopene

由图7可知，随提取次数的增加西瓜番茄红素的得率逐渐升高，提取1次与提取2次的得率相差较大，提取2次与提取3次的得率相差不大。

3.4 析因试验结果

析因试验结果见表4。

表4 析因试验结果Table 4 The results of factorial experiments

析因试验结果见表4，析因试验分析结果见表5。

表5 析因试验结果分析Table 5 The results of factorial experiment analysis

由表5可知，因素χ1、χ2、χ3、χ4对西瓜番茄红素得率均具有正效应，其中因素χ1和χ2影响显著，因素χ3和χ4影响不显著。由于析因试验只能分析各因素对试验指标影响的显著性，不能确定最佳点所在的区域，利用响应面分析法进行回归拟合，只有在最佳点附近才能充分近似真实情形，因此，需要根据各因素对试验指标影响的差异情况，进行最陡爬坡试验确定最佳点[14]。析因试验结果分析见表5。

3.5 最陡爬坡试验结果

最陡爬坡试验结果见表6。

从表6可知，随着爬坡试验的进行，在3号试验处达最高点，该点对应的试验条件为提取温度46℃，料液比为1∶19（g/mL），提取时间75 min，提取次数3次，此时西瓜番茄红素的得率接近最佳点，可以选择这一点作为响应面分析试验设计的中心点。

表6 最陡爬坡试验结果Table 6 The results of steepest ascent experiments

3.6 响应面分析试验结果

响应面分析试验结果见表7，回归分析结果见表8，方差分析结果见表9。

表7 响应面分析试验结果Table 7 The results of response surface methodology experiments

表8 回归分析结果Table 8 The results of regression analysis

表9 方差分析结果Table 9 The results of variance analysis

对表7的试验结果进行回归分析，得到以西瓜番茄红素得率Y为因变量，以X1、X2为自变量的回归方程如下：

由表9回归方程的方差分析结果可知，Pr= 0.000 249＜0.05，所以方程的回归显著，失拟不显著，可利用回归方程拟合试验数据，对试验数据进行分析。

根据回归方程，利用MATLAB软件绘制X1、X2对西瓜番茄红素得率Y的响应曲面图及等高线图，见图8。

图8 响应面分析立体图（X1，X2）和对应等高线图Fig.8 Response surface and corresponding contour plot（X1，X2）

由表8、图8可知：提取温度和料液比与西瓜番茄红素得率有显著的相关性，料液比对西瓜番茄红素得率的影响更为显著，提取温度和料液比的交互作用对西瓜番茄红素得率的影响不显著。

为了获得西瓜番茄红素最佳的提取条件，将回归方程分别对自变量X1及X2求一阶偏导并令其等0，得二元一次方程组，求解方程组，得出回归模型的极值点为：X1=－0.225 0，X2=－0.243 6，对应的实际值为提取温度45.325℃，料液比为1∶18.269 2，此时西瓜番茄红素最大得率为Y=2.713 3 mg/g。

验证试验：结合实际操作情况，将西瓜番茄红素提取最佳条件适当修正为：提取温度45℃，料液比1∶18（g/mL），提取时间75 min，提取次数3次；根据修正的条件进行3次提取试验，结果取平均值，西瓜番茄红素得率为2.740 9 mg/g，与理论预测值相差不大。

4 结论

通过试验证明，析因试验可确定对西瓜番茄红素提取影响显著的因素，最陡爬坡试验可充分逼近最大响应区域，对响应面分析试验结果进行分析，可建立显著因素与西瓜番茄红素得率关系的回归方程，通过对回归方程进行方差分析及显著性检验，利用回归方程可模拟真实的试验过程，可对最优提取条件进行预测，通过对理论预测最优条件适当修正，可确定实际操作情况下西瓜番茄红素提取的最佳工艺条件。

通过综合运用单因素试验、析因试验、最陡爬坡试验及响应面分析试验，确定利用丙酮提取西瓜番茄红素最佳工艺条件为：提取温度45℃，液料比1∶18（g/ mL），提取时间75 min，提取次数3次。在此条件下，西瓜番茄红素得率可达2.740 9 mg/g，此工艺条件在实际应用中有一定的参考价值。

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Optimization of the Extraction Process Conditions of Watermelon Lycopene by Response Surface Methodology

LI Jie，LUO Jian-cheng，LI Hui-xing，WANG Ying
（College of Biological and Chemical Engineering of Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

The extraction process conditions of watermelon lycopene were deeply studied through single factor experiment，factorial experiment，the steepest ascent experiment and response surface analysis experiment in order to determine the optimum extraction process conditions of watermelon lycopene.The results showed that the extraction temperature and solid-liquid ratio were significant factors which have effect on the yield of watermelon lycopene.The optimum extraction process conditions of watermelon lycopene were：extraction temperature 45℃，solid-liquid ratio 1∶18（g/mL），extraction time 75 minutes，extraction times 3.The yield of watermelon lycopene could reach 2.740 9 mg/g under these conditions.

watermelon lycopene；extraction process；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.012

2016-08-19

李杰（1978—），男（汉），讲师，硕士，主要从事植物中天然生物活性成分的分离和应用研究。