黑龙江省猪场潜在肠出血性大肠杆菌分离鉴定及其遗传相关性分析

孙奇，姜成刚

（1.黑龙江省兽药饲料监察所，哈尔滨 150069；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150069）

黑龙江省猪场潜在肠出血性大肠杆菌分离鉴定及其遗传相关性分析

孙奇1，姜成刚2*

（1.黑龙江省兽药饲料监察所，哈尔滨 150069；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150069）

肠出血性大肠杆菌感染是由肠出血性大肠埃希杆菌（EHEC）引起的肠道传染病。EHEC为出血性肠炎的病原，主要有大肠埃希杆菌O157 ϑ H7，是1982年新发现的一种致腹泻大肠埃希杆菌。此外，其他血清型如O5、O26、O91、O111和O113大肠杆菌也对人类公共卫生造成严重威胁。黑龙江省养猪业发达，试验在黑龙江省5个规模化猪场采集发生腹泻的仔猪粪便样品，进行肠出血性大肠杆菌分离鉴定及其遗传相关性分析。

肠出血性大肠杆菌；仔猪；腹泻；血清型

肠出血性大肠杆菌是重要食源性病原之一，可以引起严重的胃肠道疾病，包括致死性感染，在世界范围内均有发病的报道[1]。EHEC不仅产生潜在细胞毒性，而且还获得紧密方式粘附与肠粘膜上[2]。往往通过菌株携带的毒力因子而进行命名，因此菌株都携带溶血素毒力基因（大多数产生一个EHEC特异溶血素编码的质粒，hlyA基因编码），携带一种志贺菌株（stx1或stx2），许多菌株还产生致密素，97 ku粘附蛋白，由eaeA基因编码[3-5]。虽然在世界各地大肠杆菌O157为主要EHEC血清表型，其他血清型如O5、O26、O91、O111和O113大肠杆菌也对人类公共卫生造成严重威胁[6]。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2016年黑龙江省5个规模化猪场仔猪发生腹泻，采集肛门拭子120份，至含15%甘油生理盐水中，-20℃保存备用。

1.2 细菌分离鉴定

通过大肠杆菌显色培养基（青岛海博生物技术有限公司）分离纯化菌株，并应用大肠杆菌生化试纸条API 20 E（法国梅里埃）及大肠杆菌特异性16SRNA基因PCR进行鉴定[7]。

1.3 毒力因子检测

设计stx1、stx2、eaeA和ehxA基因引物，并送至上海invitrogen生物技术有限公司合成引物[8-10]。应用北京全式金生物技术有限公司Easy Pure Ge⁃nomic DNA Kit提取细菌DNA，2×EasyTaq PCR Su⁃per Mix试剂盒对目的片段进行扩增。反应体系：DNA模板4 μL，上游引物1 μL（10 mmo·L-1），下游引物1 μL（10 mmo·L-1），2×EasyTaq PCR Su⁃per Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，总体系25 μL。基因扩增反应条件根据文献报道进行。取PCR扩增产物6 μL，点样于1%琼脂糖凝胶（含0.5 μg·mL-1溴化乙锭），以DNA Marker DL2000作为标准分子量参照，在120 V的电场强度下，于1×TAE缓冲液中电泳30 min，结束后于凝胶成像系统观察并拍照。

1.4 分离株血清型鉴定

在中国兽医药品监察所购买大肠杆菌O抗原阳性血清，按照使用说明书，利用玻板、试管凝集试验测定O抗原类型。

1.5 药物敏感性实验

采用纸片扩散法（K-B）进行分离菌的药物敏感性试验。将菌液稀释至0.5个麦氏单位，用灭菌棉签蘸取菌液，均匀涂布于普通琼脂平板表面，待平板表面干燥后，用小镊子夹取抗生素纸片，按一定距离分别贴于平板上，置37℃恒温培养24 h取出，用卡尺测量抑菌圈的直径，根据NCCLS标准，判定其对各种药物的敏感性[11]。分别选取四环素、环丙沙星、氨苄青霉素、哌拉西林、氯霉素、头孢呋辛、链霉素、丁胺卡那霉素、头孢他啶、庆大霉素、妥布霉素、磺胺合剂共计12种药敏纸片进行试验。

1.6 菌株遗传进化分析

采用基因间重复单位EIRC-PCR方法，合成引物EIRC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，PCR反应体系，总体积25 μL中10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs 2 μL，引物2 μL（10 pmol），TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2.5 μL，双蒸水15.5 μL；以TE代替模板做空白对照。PCR反应条件：94℃预变性2 min（第1个循环），然后94℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸4.5 min，以此进行35个循环，72℃延伸1min后结束反应[12]。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳1 h，凝胶成像仪观察拍照，记录结果。对于EIRC-PCR电泳指纹，用Quantity One软件采用非加权配对算术平均法（UpGMA）聚类，生成分离菌株遗传进化树形图。

2 试验结果

2.1 菌株的分离

将肛门拭子接种到大肠杆菌显色培养基，37℃培养24 h，挑取典型大肠杆菌蓝绿色菌落接种到液体LB培养基纯培养，经过生化反应和16SRNA PCR鉴定，共分离猪源大肠杆菌78株。

2.2 菌株毒力因子鉴定

毒力因子PCR检测结果表明，有34株大肠杆菌携带ehxA基因，占总数的43.6%；有2株同时携带ehxA和eaeA基因；有1株同时携带ehxA、eaeA和stx1基因。

2.3 菌株血清型鉴定

经中国兽医药品监察大肠杆菌阳性血清凝集实验结果表明，除2株未能鉴定出血清型，其余菌株分布于9种血清型中，优势血清型为O92（9株）、O4（7株）和O26（5株），分别占总数的26.5%、20.6%和14.7%。同时2株携带ehxA和eaeA基因菌株血清型分别为O26和O92，1株，同时携带ehxA、eaeA和stx1基因血清型为O26。

2.4 菌株药物敏感性

药物敏感性试验结果表明，临床分离株对四环素耐药性最高达100%，余下依次为环丙沙星为94.5%，氨苄青霉素为93.6%，哌拉西林为90.2%，氯霉素为82.6%，头孢呋辛为78.6%，链霉素为66.7%，丁胺卡那霉素为57.2%，头孢他啶为42.9%，庆大霉素为33.4%，妥布霉素为19.1%，磺胺合剂为18.3%。该猪场34株携带ehxA大肠杆菌均有不同程度的耐药，而且均表现多重耐药，最小3耐，最多11耐，平均达7耐。携带ehxA毒力基因大肠杆菌中，耐药性均在6耐以上，其中O26血清型均在8耐以上，其中携带ehxA、eaeA和stx1 3种毒力基因的大肠杆菌为11耐，仅对妥布霉素敏感。

2.5 菌株遗传进化分析结果

应用EIRC2引物对分离菌株DNA进行扩增，琼脂糖电泳显示在7 500 bp以下呈现大小不等的扩增片段，根据菌株条带分子大小和个数的不同，应用Quantity One软件，聚类方法采用UP⁃ GAMA进行分析。从遗传距离生成的树形图（附图）可知，在相似性系数0.49时78株人肠杆菌明显分成A、B、C、D、E、F、G、H，8个基因型，主要基因型为D型，19株菌，占分型菌株的24.4%；其次基因型为H型，16株菌，占分型菌株的20.5%；最少基因型为基因A型只有2株菌。34株携带ehxA毒力因子大肠杆菌分不在7个不同群，B群2株、C群3株、D群8株、E群8株、F群3株、G群4株、H群6株。同时携带ehxA和eaeA2株菌分别在H群和D群，同时携带ehxA、eaeA和stx1菌株在H群。

附图 猪源大肠杆菌遗传进化分析

3 讨论

本研究报道了5个大型猪场发生腹泻，对流行大肠杆菌特性进行分析，以往致猪腹泻大肠杆菌常为K88、K99、F41、F18及987P[13]。而本研究关注点为致腹泻大肠杆菌携带ehxA、eaeA及stx1和stx2的情况，以评价对人类潜在威胁，本研究表明，在黑龙江省发生仔猪腹泻大型猪场中，分离大肠杆菌携带ehxA占43.6%，ehxA毒力基因以往研究表明在牛腹泻病例中携带较高，在牛STEC菌株中溶血素毒力基因携带率为46.7%～70.0%，在猪源大肠杆菌中相关报道较少[14-15]。溶血素毒力基因广泛分布在STEC菌株中，虽然该毒力基因引起腹泻的机理还不是十分清楚，但这个基因与志贺毒素存在某些协同作用，其也常常用来判定产志贺毒素大肠杆菌的诊断标记物[16]。

大肠杆菌通常存在于动物和人类的肠道内。目前，大肠杆菌通常用来检测饮用水是否安全的一项重要指标。有几种途径可以造成大肠杆菌对水源的污染，包括人类、养殖场、野生动物、水禽及宠物[17-18]。确定水源污染大肠杆菌来源途径，对于建立正确风险评估机制和预防措施都十分重要。

在哺乳动物肠道内大部分大肠杆菌都是共生无害的，而某些菌株可以引起人类发生疾病。大肠杆菌可以产生志贺毒素（stx1和stx2），为产志贺毒素大肠杆菌（STEC），可以引起人类血性腹泻以及潜在致命性疾病，包括溶血性尿毒血症HUS和出血性肠炎，许多STEC菌株携带一个大的毒力质粒（60～121 kb），编码各种毒力因子，包括溶血素毒力基因（由ehxA基因编码）[19-20]。

一些致病性STEC菌株同样携带位于染色体上的毒力岛，简称肠道上皮细胞损伤位点（LEE），这些菌株通常称为肠溶血性大肠杆菌（EHEC），LEE区域包含一个编码Ⅲ型分泌系统编码的基因和一个转运蛋白，这些蛋白对于大肠杆菌的粘附及致病变作用是必需的，如致密素（由eae基因编码），LEE对于大肠杆菌初级阶段的感染起到重要作用，从病人分离菌株大多数发生HUS综合征的STEC株往往都LEE阳性，然而这个区域引起人类疾病不是必需的，在发生HUS综合征的病人分离菌株也存在缺少LEE毒力岛的STEC菌株[19,21-22]。由于LEE区域基因遗传保守型，检测eae基因可以用来表明整个LEE区域的存在[23]。

本研究中分离的菌种共分布在17种血清型中，携带毒力因子的血清型主要为O92、O4和O26，其中血清型O26与其他哺乳类动物和人类大肠杆菌强致病性菌株相一致，存在不同种属动物之间及动物与人类之间传播的可能。由于抗生素滥用，猪源性细菌耐药性也十分严重，本研究分离菌株呈现多重耐药性，携带三毒力因子（ehxA、eaeA和stx1）菌株为11耐，超级细菌的出现正是携带超强毒力因子与超强耐药基因的强强联合的产物。

应用EIRC方法对分离菌株进行基因进化分析，结果表明携带毒力基因的菌株主要在H群和D群。携带毒力基因的质粒可以通过转接和转化等方式在菌株中互相传播，使无致病力菌株或低致病力菌株变为强致病力菌株，耐药性也可以通过耐药质粒进行传播，使致病菌的耐药性进一步增强，如果不加以控制，动物源性的超级细菌就会慢慢产生，势必对人类公共卫生安全造成巨大威胁[24]。

4 小结

综上所述，携带ehxA毒力基因的猪源大肠杆菌可以引起仔猪腹泻，ehxA可以编码于噬菌体，导致其在大肠杆菌中持续传播，在发生腹泻猪大量分离到EHEC菌株。暗示猪也是EHEC一个重要宿主，也大大增加从养殖场传播给人类潜在致病性，应该引起兽医工作者足够重视[25-32]。

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Isolation Identification and Genetic Correlation Analysis of Escherichia coliIsolated from Swine Farms in Heilongjiang Province

SUN Qi1,JIANG Chengang2*

（1.Heilongjiang Provincial Veterinary Medicine Feed Monitoring Institute,Harbin 150069,China；
2.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China）

Enterohemorrhagic Escherichia coli infection is a kind of intestinal infectious disease caused by EH⁃EC.EHEC is the causative agent of hemorrhagic enteritis,mainly Escherichia coli O157:H7,was a new discovery in 1982 caused by diarrhea Escherichia coli.In addition,other serotypes such as O5,O26,O91,O111,and O113 also posed a serious threat to human health.The test collected fecal samples of diarrhea piglets,isolation and identification of Escherichia coli and analysis of the genetic correlations in Heilongjiang Province 5farms.

Escherichia coli;piglet;diarrhea;serotype

S828；S852.61+2

A

1001-0084（2017）03-0042-05

2017-02-14

孙奇（1989-），男，吉林长春人，助理畜牧师，研究方向为兽药及饲料检验检测。

*通讯作者：副研究员，E-mail:jcg5168@163.com。